| Project/Area Number |
22K05384
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
益田 時光 九州大学, 農学研究院, 助教 (90778060)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
本城 賢一 九州大学, 農学研究院, 准教授 (00264101)
宮本 敬久 九州大学, 農学研究院, 教授 (70190816)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2025: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | バクテリオファージ / ゲノム編集 / リーダーレスバクテリオシン / CRISPR-Cas / leaderless bacteriocin / bacteriophage / tail fibers |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、食中毒細菌の制御を目的として、CRISPR -Casシステムに代表されるゲノム編集技術を用いたバクテリオファージ（以降ファージ）遺伝子改変技術の基盤の構築と改変ファージの応用を目指す。特に、ファージの宿主特異性を担うテイルファイバーについての改変や、宿主菌のゲノム中にファージゲノム情報が入り込んでしまう溶原化に関連する遺伝子を特定、取り除くことで安全性の高い溶菌ファージに変換することなどを目指す。また、宿主菌のファージ耐性化を防ぐための抗菌力強化のために、３）抗菌ペプチドリーダーレスバクテリオシン（LLB）産生ファージ（以降LLBファージ）の作製とその応用についての検討を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、食中毒細菌の制御を目的として、CRISPR -Casシステムに代表されるゲノム編集技術を用いたバクテリオファージ（以降ファージ）遺伝子改変技術の基盤の構築と改変ファージの応用を目指し、以下の研究を行う。ゲノム編集によるファージ特性の改変として、１）複数テールファイバー（以降TF）遺伝子を保持するファージ（マルチテールファイバーファージ：以降MTFファージ）における宿主特異性とTF遺伝子の関連性の解明とその応用、２）溶原化関連遺伝子群や毒性遺伝子をゲノム編集によって取り除き、有用な溶菌ファージへと特性を改変させることを目指して研究を進めてきた。また、ファージ耐性化を防ぐための抗菌力強化のために、３）抗菌ペプチドリーダーレスバクテリオシン（LLB）産生ファージ（以降LLBファージ）の作製とその応用についての検討を進めてきた。
MTFファージについては、大腸菌ファージECP52において、gp136,137の２遺伝子が宿主域の可変性に関与していることが示され、ECP52は複数の宿主認識機構を利用して感染していることが示唆された。
溶原化関連遺伝子については、これまでにintegraseやlexAなどの４遺伝子の発現が一定でなく、CRISPR-Cas10による編集が困難となっており、S. aureusにおけるCRISPR-Cas9ゲノム編集システムの構築を現在進めている。
LLBファージについては、S. aureus感染性のPSARaを用いて作ったL-vPSARaなどを用いて、S. aureusのバイオフィルムに対する抗菌活性などを調べた結果、オリジナルよりも非常に活性が高いことが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
MTFファージにおいては、ECP52における可変的な宿主域に重要な２遺伝子の特定ができた。当初の予定ではファージゲノムに外来のTF遺伝子を導入する予定であったが、ゲノム編集の困難さ等を鑑みて、現在は宿主自身にTF遺伝子を発現させた状態で溶原ファージを感染させる方法でMTFファージの作製を試みている。
溶原化関連遺伝子の欠損については、４遺伝子の個別の欠損を試みてきたが、これまで用いてきたCRISPR-Cas 10システムがそれぞれの遺伝子の発現状態に依存してしまうため、より汎用性の高いCRISPR-Cas9システムの構築を進めている。
LLBファージについては、E. coliファージ、S. aureusファージ共に良い結果が得られており、2024年度中に論文投稿を目指す。
以上のように、溶原化関連遺伝子については少し遅れが生じているが、LLBファージやMTFファージの方で予定以上に進展しているといえるため、総じて概ね順調にきているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、T4ファージの宿主大腸菌にECP52由来のTF遺伝子を発現させ、そこにT4ファージを感染させることでシングルユースなMTFファージの作製を目指す。また、ECP52において確認されたgp136,137の可変的な宿主域への関連性を、T4ファージ内の類似遺伝子の欠損を行うことでさらに解析していく。
溶原化関連遺伝子については、CRISPR-Cas9システムの構築、各遺伝子の欠損をおこなっていく予定である。
LLBファージについては、特にS. aureusファージを用いてより強力で汎用性の高いLLBファージの構築を目指して実験を進めていく。
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