| Project/Area Number |
22K05397
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
八代田 陽子 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 副チームリーダー (60360658)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平井 剛 九州大学, 薬学研究院, 教授 (50359551)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 細胞間コミュニケーション / 分裂酵母 / オキシリピン / 生合成 |
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| Outline of Research at the Start |
分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）がオキシリピンをつかって行う同種細胞間コミュニケーションについて、オキシリピンの生合成経路や産生条件を、酵母の遺伝学的解析と質量分析技術を用いて同定する。本研究は、S. pombeの種の生存戦略である細胞間コミュニケーションの意義を、コミュニケーション因子の生合成の観点から明らかにすることを目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞が分泌する化合物を媒介物質として行う細胞間コミュニケーションは、微生物が環境に適応するための生存戦略と言える。研究代表者らは、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）が示す奇妙な「適応生育」現象の発見から、S. pombeがオキシリピンをつかって同種細胞間コミュニケーションを行い、窒素源取り込みを制御していることを発見した。本研究では、このオキシリピンの生合成経路や産生条件を、遺伝子過剰発現株ライブラリーと質量分析技術を用いて同定する。また、異種酵母によるNSF産生量も測定し、環境における同種、異種酵母とのコミュニケーションについて考察する。本研究は、S. pombeの「化学コミュニケーション＝種の生存戦略」の意義を、コミュニケーション因子の生合成の観点から明らかにすることを目的とする。2023年度は薄層クロマトグラフィーによりS. pombe非必須遺伝子破壊株ライブラリーからのNSF生合成に関与する遺伝子スクリーニングを実施し、NSF生合成に関わる候補遺伝子を１つ見出した。また、ラベル化オレイン酸を用いたBioconversion実験により、NSF生合成の基質がオレイン酸であることを示した。さらに、異種酵母（S. cerevisiae、S. japonicus、S. octosporus）を用いた適応生育試験を行い、NSFがS. pombe特異的な細胞間コミュニケーション因子であることを示唆する結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2023年度は薄層クロマトグラフィー（TLC）によりNSF（Ac8Z、Hy8Z）を分離させる方法を用いて、NSF生合成に関与する遺伝子スクリーニングを実施した。約3,400個のS. pombeの非必須遺伝子破壊株について、細胞内粗脂質をクロロホルムとメタノールをつかって調製し、細胞内NSF産生量をTLCにより検出した。その中から、野生株からの細胞内粗脂質と比較して、Ac8Zはほとんど検出されない一方でHy8Zが過剰量蓄積している遺伝子破壊株を１株見出した。液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）を用いて定量して検証したところ、その遺伝子破壊株の培養上清にも細胞内にもAc8Zはほぼ検出されず、しかし、Hy8Zは野生株よりも数十倍以上蓄積していた。この結果より、この遺伝子がHy8Zのアセチル化を担う遺伝子をコードしていると示唆された。
また、ラベル化オレイン酸を用いたBioconversion実験を行った。野生株の培養時にラベル化オレイン酸を添加し、LC-MSにより培養上清、細胞内のラベル化NSFの定量を行った。ラベル化オレイン酸の添加量に応じて、培養上清、細胞内にラベル化NSFが検出された。よって、オレイン酸がNSF生合成の基質であることが示された。
さらに、異種酵母を用いて適応生育活性試験を行った。S. cerevisiaeおよびS. japonicus、S. octosporus、S. pombeの培養上清を用いて、寒天培地上でのeca39破壊株の適応生育試験を実施したところ、S. pombe以外はeca39破壊株の適応生育を誘導できなかった。このことからS. pombeの培養上清に含まれるNSFはS. pombe特異的な細胞間コミュニケーション因子であることが示唆された。
以上のことから、おおむね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回同定したAc8Zの生合成を担う遺伝子については、遺伝学的、分子生物学的、生化学的手法を駆使して、その遺伝子産物の特徴づけを行う。Bioconversion実験の結果、オレイン酸が初発基質であることが示されたが、オレイン酸からHy8Zへの変換を担う酵素の候補が未同定であるので、必須遺伝子も含めて候補になる遺伝子を洗い出し、遺伝学的手法のみならず、生化学的手法の確立も検討して、その酵素の同定に挑戦する。また、異種酵母の培養上清、細胞内のNSFをLC-MS等で定量して確認し、NSFがS. pombe 特異的な生成物であるかどうかを検討することにより、環境における同種、異種酵母とのコミュニケーションについて考察する。
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