パンコムギのアレルゲンとなるグルテンタンパク質を包括的に制御する転写因子の同定

• Project/Area Number: 22K05574
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 39010:Science in plant genetics and breeding-related
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 川浦 香奈子 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 准教授 (60381935)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: パンコムギ / ゲノム編集 / グルテン / 転写因子 / 小麦アレルギー

Outline of Research at the Start

小麦アレルギーの原因となるタンパク質には小麦粉のグルテンの構成成分である種子貯蔵タンパク質が含まれる。コムギにおいて、ゲノム編集技術により任意の遺伝子のノックアウトが行えるようになったが、種子貯蔵タンパク質は多重遺伝子にコードされているため、アレルゲンを減らすために遺伝子を個別にノックアウトすることは困難である。そこで、これらの多重遺伝子の発現を制御する転写因子を同定し、転写因子をゲノム編集技術によりノックアウトすることで低アレルゲン化した系統の作出を行う。

Outline of Annual Research Achievements

小麦アレルギーの原因となるタンパク質の中で、小麦粉のグルテンの構成成分である種子貯蔵タンパク質の組成の改変を目的にゲノム編集を行った。コムギにおいてゲノム編集技術により任意の遺伝子をノックアウトできるが、種子貯蔵タンパク質は多重遺伝子にコードされているため、個別にノックアウトするのは現実的ではない。そこで、これらの多重遺伝子の発現を制御する転写因子をノックアウトすることで、多重遺伝子を包括的に制御することを目的とした。これにより、アレルゲンとなる種子貯蔵タンパク質遺伝子の発現を制御した低アレルゲン小麦の作出が可能であるか検討する。
コムギ品種Fielderを用いて種子貯蔵タンパク質を制御する転写因子の候補であるSPA、SHPについて、それぞれ3種の同祖遺伝子を標的としてパーティクルガンを用いてCRISPR/Cas9によるゲノム編集を行った。SPAを標的としたゲノム編集では、3種の同祖遺伝子に変異が導入された遺伝子型aabbddとなる系統が得られた。この系統のT1系統を栽培したところ、出穂期に影響があることが示唆された。しかし、着粒した種子からタンパク質を抽出し、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにより評価したが、野生型との違いは見られなかった。SPAは、in vitroの実験で種子貯蔵タンパク質の発現を誘導することが報告されているが、機能欠失変異体では種子貯蔵タンパク質の発現に影響しないことが示唆された。一方で、SHPについては、標的配列の選定や複数の標的配列をターゲットとしたgRNAを複数導入することや培養条件の検討を行ったが、変異体を得ることはできなかった。今後、ゲノム編集の高効率化によりSHPの変異体を作出し、SPAの変異体と組み合わせることで、コムギにおけるこれらの転写因子の種子貯蔵タンパク質の発現に与える影響を明らかにすることができると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、コムギにおける種子貯蔵タンパク質遺伝子を制御する転写因子を同定し、高効率化したゲノム編集技術によりアレルギーの原因となるタンパク質の蓄積を抑制した系統を作出することを目的とし、（１）コムギの転写因子の評価およびこれらを変異させたゲノム編集系統の作出、（２）コムギにおけるゲノム編集法の高効率化、（３）ゲノム編集による変異系統の評価、を計画した。（１）の転写因子の評価は前年度に概ね終了しており、今年度はゲノム編集系統の作出に至った。（２）のゲノム編集法の高効率化は、遺伝子によっては確立できた。（３）の変異系統の評価も行った。これらのことから、概ね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

作出したSPAの変異体について、表現型の評価を詳細に行う。種子貯蔵タンパク質以外に影響することが示唆されたため、それらを検証する。また、SHPをノックアウトしたパンコムギ系統の作出に注力する。そのため、CRISPR/Cas９の発現ベクターやゲノム編集の標的配列の選出法、ゲノム編集のコンストラクトを導入した後の培養条件などを検討し、ゲノム編集の高効率化を目指す。さらに、トウモロコシで種子貯蔵タンパク質遺伝子の発現に関係することが報告された転写因子について、コムギでのホモログを選出し、ゲノム編集系統作出に着手する。これらの転写因子の3種の同祖遺伝子が変異した複数の系統を早期に得て形質の評価を行い、それぞれの転写因子の生体での機能の解明を目指す。また、変異体を組み合わせて転写因子の相互作用による機能解明を行う。