| Project/Area Number |
22K05837
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 40040:Aquatic life science-related
|
|---|
| Research Institution | Osaka Metropolitan University |
|---|
Principal Investigator |
吉原 静恵 大阪公立大学, 大学院理学研究科, 助教 (20382236)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
|
|---|
| Keywords | cold shock protein / 褐虫藻 / 転写因子 / 低温ショックドメイン |
|---|
| Outline of Research at the Start |
近年、海水温上昇などによるサンゴ死滅が問題とされており、サンゴの成長を支える共生藻（褐虫藻）の生態を分子レベルで理解することは非常に重要である。
代表者は、工業製品として利用される酸化亜鉛ナノ粒子を褐虫藻に暴露すると、細胞増殖が対照比3.5に増加し、暴露24時間以内に褐虫藻の転写因子候補である低温ショックドメインタンパク質（CSP）の発現が誘導されることを見出した。
本研究は、褐虫藻CSPについて、大腸菌発現タンパク質の核酸結合活性と、生体内における機能を調べることによって、褐虫藻CSPの機能解明に迫る。原核から真核生物まで普遍的に存在するCSPの研究に重要な知見を得ることができる。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者は、褐虫藻（Breviolum minutum, Bm）をはじめとする藻類やシアノバクテリア、タバコカルスの液体培地に酸化亜鉛ナノ粒子を添加すると、細胞増殖が促進されることを見出してきた。褐虫藻はサンゴに共生してサンゴ形成を支える重要な生物であるが、その生育制御の分子機構に関する知見は乏しい。そこで、酸化亜鉛ナノ粒子の添加によって細胞増殖が促進する際に発現が変動する遺伝子に着目した。先行研究のRNA-seq解析から、転写因子Cold Shock Protein (CSP)が細胞増殖制御に関わる可能性が示唆された。本研究では、酸化亜鉛ナノ粒子を添加した際に発現が誘導される2種類のBmCSP (BmCSP1、BmCSP2)に着目し、これらの因子による細胞増殖促進の分子機構を明らかにすることを目的とする。以下に示す5つの研究計画を進めている。
計画① BmCSP1、BmCSP2タンパク質の大腸菌発現系構築と核酸結合解析、計画② 凍結への感受性が報告されているシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana, At）Atcsp3変異株にBmCSP1またはBmCSP2を導入した遺伝子組換え株の作出、計画③ Atcsp3変異株に、BmCSP1またはBmCSP2の核酸結合領域（Cold Shock Domain, CSD）をシロイヌナズナAtCSP3のCSDと置換したAtCSP3_BmCSD1またはAtCSP3_BmCSD2を導入した遺伝子組換え株の作出、計画④ ②③で作出したシロイヌナズナ株の表現型解析、計画⑤ ②③で作出したシロイヌナズナ株のmRNA-seq解析
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在までの進捗状況を、【研究実績の概要】に示した研究計画に沿って報告する。
計画① BmCSPタンパク質の大腸菌発現系構築と核酸結合解析
BmCSP1： glutathione S-transferase (GST, 226 amino acids）タグ融合タンパク質として大腸菌で安定に発現し、精製できた。ネガティブコントロールのGSTとGST-BmCSP1を以降の核酸結合解析に使用した。GSTは大腸菌やコムギのCSP精製に用いられており、核酸結合活性を示さないことが示されている（JBC, 1997, 272, 196; JBC, 2002, 277, 35248）。しかし、double stranded (ds) DNAとしてpUC118を用いたゲルシフトアッセイは、GST、GST-BmCSP1ともにpUC118との相互作用を示した。GSTタグを除去するとBmCSP1は不溶化したため、BmCSP1特異的なdsDNA結合活性を示すことができていない。一方、GST、GST-BmCSP1ともにluciferase mRNA、47 baseから成るsingle stranded (ss) DNAとの結合活性を示さなかった。BmCSP2：褐虫藻cDNAライブラリーからクローニングできなかったため、大腸菌に最適化したコドンを持つBmCSP2遺伝子を人工的に合成した。GSTまたはHisタグ融合タンパク質として大腸菌で発現、精製することができた。今後、dsDNA、ssDNA、RNAとの結合解析を進めている。
計画② BmCSP1を発現するシロイヌナズナの作出と、計画③ Atcsp3 変異株にBmCSD1を含むAtCSP3を導入したシロイヌナズナの作出は、形質転換体の選抜を終えた。BmCSP2について、計画②③が進行中であるため、進捗状況はやや遅れていると報告する。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、2種類の褐虫藻CSP (BmCSP1、BmCSP2)による細胞増殖促進の分子機構を明らかにすることを目的としている。2024年度は、以下の④、⑤を計画しているが、これまでに得られた結果から変更を加えた推進方策を示す。
計画④：計画②では、低温感受性を示すシロイヌナズナAtcsp3株にBmCSP1またはBmCSP2を導入し、低温感受性などの表現型への影響を調べる予定である。BmCSP1導入株は作出済みであるが、計画①において現時点ではBmCSP1核酸結合活性を確認できていない。表現型に差異が認められた場合は、転写因子とは異なる機能を持つ可能性を考察する。
BmCSP2についても同様に、早急に核酸結合活性の結果を得て、BmCSP2を導入したシロイヌナズナの作出を進め、表現型への影響を調べる予定である。BmCSP2の核酸結合活性が確認された場合は、転写因子としての機能を考察する。
計画⑤：BmCSP1またはBmCSP2を導入したシロイヌナズナ株を用いて、mRNA-seq解析を実施し、BmCSP1またはBmCSP2の導入によって発現レベルが変動した遺伝子を同定する。すでに実施したBmCSP1とBmCSP2のChIP-seq解析結果と合わせて、褐虫藻におけるCSPの機能や、既知のCSPの機能との共通性について考察する。
計画⑥：計画①において、BmCSP1核酸結合活性を確認できていない。先行研究の酸化亜鉛ナノ粒子暴露時の RNA-seq解析から、BmCSP1またはBmCSP2とは異なるCSP遺伝子が恒常的に高発現することを見出している。この因子（BmCSP3）を大腸菌発現系を用いて調製し、dsDNA、ssDNA、RNA結合活性を調べる。
2022年度から2024年度までに得られた結果を総合して、褐虫藻のCSPについて、核酸結合活をまとめ、細胞増殖制御に関わる機能を考察する。
|
