Development of a treatment for rabies based on metabolomic analysis

• Project/Area Number: 22K06029
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 山田 健太郎 宮崎大学, 農学部, 教授 (70458280)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2022: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: 狂犬病 / メタボローム / キヌレニン経路

Outline of Research at the Start

狂犬病は狂犬病ウイルスによって引き起こされる致死率ほぼ100%の感染性脳炎で、発症後の有効な治療法は未だ確立されていない。これまでに研究代表者は、狂犬病ウイルス野外株においてG蛋白質L38R変異がマウスにおいて弱毒化していることに加え、感染マウス血清の比較メタボローム解析により、L38R変異株感染では、あるアミノ酸の代謝産物の一つが上昇していることを見出した。この代謝産物には生理活性があり、炎症反応により誘導される経路によって生成される。そこで本研究では、L38R変異株の弱毒化にはその経路の誘導が関与することを証明し、さらに狂犬病治療に有効な代謝産物や責任酵素の同定を試みる。

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、未だ治療法のない狂犬病について、狂犬病ウイルスの弱毒化機構を解明することで、その治療法の確立を目指すものである。すなわち、弱毒株が感染した場合に宿主から排除されるメカニズムを解明し、それを野外株(強毒株)感染において再現させることで、狂犬病の治療が可能か検討を行うものである。以前に、狂犬病ウイルス野外株(1088株)G蛋白質においてN型糖鎖の効率的な付加をもたらすL38R変異がマウスの末梢ルートからの感染において弱毒化、つまり変異ウイルスは脳に至るも排除されることを見出しており、さらに感染マウス血清の比較メタボローム解析により、変異株感染では野外株感染に比べて、トリプトファンの代謝経路であるキヌレニン経路の代謝産物の一つであるキノリン酸の有意な上昇が確認されたことから、本研究計画を立案したところである。宮崎大学ではまだ組換え狂犬病ウイルス（BSL3）が使用できなかったため、昨年度は大分大学で残余マウス血清を用いた市販のELISAキットにより、変異株感染マウスにおいてキヌレニン経路の代謝産物であるトリプトファン、キヌレン酸、およびキノリン酸の上昇を確認することができた。
今年度は昨年度末に宮崎大学でのABSL3実験室セットアップ完了に伴い、組換え狂犬病ウイルスの使用について学内申請や大臣確認申請を行い、大臣確認申請については2024年3月8日に確認が得られ、現在、大分大学からの譲渡・移動の手続きを進めているところである。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

宮崎大学におけるABSL3実験室が2022年度末に設備が整い稼働開始となり、それを以て、組換え狂犬病ウイルス使用のための学内申請や大臣確認申請を行い、大臣確認申請については2024年3月8日に確認が得られ、現在、大分大学からの譲渡・移動の手続きを進めているところである。

Strategy for Future Research Activity

組換え狂犬病ウイルス株を宮崎大学に移送して研究継続する。移送にあたり法令を遵守する(感染症法、カルタヘナ法)。2024年度は計画に沿って下記のように進 める。
1. 弱毒株感染マウスにおけるキヌレニン経路に関する発現解析: 感染マウスの各組織等におけるキヌレニン経路に関する酵素遺伝子・代謝産物(中間物質も含む)について発現解析をRT-qPCRやELISAにより行い、治療候補となる分子の絞り込みを行う。
2. L38R変異株感染マウスにおける脳内トランスクリプトーム解析: RNA-seq等による網羅的mRNA発現解析を実施し、弱毒株観戦における抗ウイルス状態に関わる と想定される脳内発現遺伝子を特定する。
3. IDO1阻害剤投与実験: 1-MT(1-methyltryptophan)はL-トリプトファンをL-キヌレニンに代謝させるIDO1酵素の阻害剤で、in vivoでの有効性も確認されてい る。そこで、L38R変異株感染マウスに1-MT投与を行い、致死的感染が起こるようになるか検討する。もしそれ が起これば、キヌレニン経路の誘導が弱毒性状に 関与すること判明するが、起こらない場合にはIDO1酵素に非依存的なキノリン酸産生経路(トリプトファン酸素添加酵素、TDOなど)が関与することが推測され、この遺伝子の発現解析も進める。
4. 代謝産物投与による再現実験: 上記1で見出された代謝産物についてマウスへの投与実験を行い、弱毒株感染マウスと同様の遺伝子変動が認められるか検証する。