ヒトヘルペスウイルス6感染に必須なウイルスリガンドの立体構造決定と機能解析
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22K06113
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
西村 光広 神戸大学, 医学研究科, 助教 (40510285)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | ヒトヘルペスウイルス6 / ウイルスリガンド / 抗体 / 立体構造解析 / 中和抗体 / X線結晶構造解析 / 構造生物学 |
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| Outline of Research at the Start |
ヒトヘルペスウイルス６はほぼ全てのヒトが乳幼児期に感染するウイルスであり、小児突発性発疹の原因となる病原体である。本研究ではその感染において鍵となる分子であるgH/gL/gQ1/gQ2に着目し、分子としての構造からその機能を明らかにすることを目的とする。gH/gL/gQ1/gQ2はヒトヘルペスウイルス6が独自にもつ分子複合体でありその立体構造は未だ明らかとなっていない。gH/gL/gQ1/gQ2の構造をX線結晶構造解析及びクライオ電子顕微鏡解析によって解明するとともに、その機能発現において重要となる受容体や抗体との相互作用を立体構造情報に基づき明らかとする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではヒトヘルペスウイルス6（HHV-6）の感染に必須なウイルスリガンドgH/gL/gQ1/gQ2の立体構造解析を行った。これまでにヒトヘルペスウイルス6B（HHV-6B）に由来するgH/gL/gQ1/gQ2を精製し、2種の抗体Fabドメインと複合体を形成させ、結晶化を行うことで最高分解能3.8 ÅまでのX線結晶回折データを得て、部分的な構造情報を得る事が出来ていた。本年度は継続的な試みとして、同試料の結晶化を行い結晶凍結法の改変を加えて大型放射光施設SPring-8 BL41XUビームラインでの回折測定を行った。53の測定データのマージを行うことで、最高分解能4.13 Åのデータを得たが、依然として構造決定には至らなかった。
構造解析試料の見直しを行うために、既に当研究グループが取得しているgH/gL/gQ1/gQ2を標的としたマウスモノクローナル抗体のスクリーニングを行った。バイオレイヤー干渉測定法で抗原への結合力を評価した結果、これまでの2種のモノクローナル抗体に加えて6種の抗体候補が見出され、その中で3種の抗体は安定な複合体を形成可能な高い親和性を持つことが明らかとなった。新規3種の抗体とこれまでの2種の抗体をそれぞれパパイン消化することでFabドメインを作製し、バイオレイヤー干渉測定法により各Fabによる抗原-抗体相互作用の競合阻害実験を行った。各抗体と自己のFabの競合がそれぞれ確認できた他に、gQ1を標的とする2種の抗体間での競合が示された。一方で、gH/gL部を標的とする他3種の抗体は、自己を除く4種の抗体のいずれとも競合しないことが示された。この結果から、gH/gL/gQ1/gQ2に最大4種の抗体Fabを結合させることが可能であるとわかり、実際にサイズ排除カラムを用いたクロマトグラフィーで複合体が形成できることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究ではヒトヘルペスウイルス6（HHV-6）の感染に必須なウイルスリガンドgH/gL/gQ1/gQ2の立体構造を原子分解能で決定することが最大の目的であるが、現時点で達成できていないため、進捗状況として「やや遅れている」を選択した。2種の抗体Fabを結合させた抗原-抗体複合体から得られた結晶は、抗原単体で得られたものに比べ、X線回折能が優れており、構造解析試料として比較的良好であったが、これまでの研究により最大分解能3.8 Åを向上させることは困難であることが示唆されている。これまでに得られた部分定な構造情報により、gH/gL/gQ1/gQ2は球状ではなく長軸が伸び捩じれた棒状構造を持つこと、またgH/gLとgQ1/gQ2間の相互作用が強固でなく、ドメイン間の配向に柔軟性を持ち得ることが示唆されている。こういった部分的な情報はＸ線結晶構造解析における回折能に優れた結晶の作製が困難であることや、クライオ電子顕微鏡解析の予備的な実験で試料配向の偏りがあったことに関連しているものと考えられる。こういった試料の物性を構造解析に向けて改変するために、今年度の研究ではgH/gL/gQ1/gQ2に結合しその立体構造を安定化し得る、新たな抗体の探索を行った。結果としてこれまでに利用してきた2種の抗体に加えて、抗原への結合力に優れた３種の抗体を新たに見出すことができた。これらの5種の抗体はそのうちの2種が共通の標的部位に結合する以外は、別々の結合部位に結合することから、抗原上の4つの部位に抗体を結合させることができることも示された。したがって、gH/gL/gQ1/gQ2の立体構造を決定する上での重要な要素となる抗体について、新たに活用可能な候補を複数見出すことができており、目標の達成に向けては進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は原子分解能のgH/gL/gQ1/gQ2複合体の立体構造を明らかとするために、gH/gL/gQ1/gQ2と新たに見出された抗体Fabとの様々な組合わせの複合体を調製し、立体構造試料として用いることで構造決定を目指す。既にこれまでとは異なる2種の抗体を組み合わせた複合体試料をサイズ排除カラムによるクロマトグラフィーで精製しており、研究協力者の助力を得て、クライオ電子顕微鏡解析を行っている。見出された抗体を抗原上の異なる四つの結合部位に結合させることができることから、計算上は20以上の抗原-抗体複合体が形成可能であり、クライオ電子顕微鏡解析の経過次第では、新たな抗体の組合せについて精製を行い、より構造解析に適した複合体試料のクライオ電子顕微鏡解析を実施する。また示差走査蛍光測定実験によりそれぞれの抗体と抗原の複合体についての熱安定性を測定することで、各抗体の選択における参考とする。gH/gL/gQ1/gQ2試料の調製に十分な余裕がある場合には、これまでに結晶化実験に用いていた組合せとは異なる抗原-抗体複合体を調製し、結晶化初期条件スクリーニング実験を実施する。そういった結晶化実験での結晶形成状況も複合体試料の物性に関する参考情報となり得るため、クライオ電子顕微鏡解析の経過や示差走査蛍光測定実験での評価結果と統合して、クライオ電子顕微鏡解析における測定試料の選択を行う。同時に結晶化条件の最適化を行うことで、Ｘ線結晶回折測定に十分なサイズの結晶が得られた場合には、研究協力者との連携により、大型放射光施設SPring-8での回折測定実験を行う。これまでのＸ線結晶構造解析での成果を考慮する限りでも、回折能が良好な新規結晶が見出された場合には本手法でも立体構造の決定は十分に可能であるため、クライオ電子顕微鏡解析と並行して立体構造解析を進める。
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Report
(2 results)
Research Products
(1 results)
