| Project/Area Number |
22K06117
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
椎村 祐樹 久留米大学, 付置研究所, 助教 (40551297)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | グレリンO-アシルトランスフェラーゼ / 構造生物学 / グレリンOアシルトランスフェラーゼ / グレリン / アシルトランスフェラーゼ / 構造解析 |
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| Outline of Research at the Start |
グレリンO-アシルトランスフェラーゼ (GOAT) は、摂食亢進ホルモンであるグレリンに脂肪酸を修飾する酵素である。近年、GOAT阻害剤が、血糖値の上昇や体重増加を抑制することなどから、糖尿病の新たな治療薬になる可能性が示唆されている。本研究は、クライオ電子顕微鏡法によってGOATの立体構造を明らかにして、GOATがどのようにしてグレリンに脂肪酸を修飾するのか、視覚的に理解することを目的としている。また本研究によってGOATの立体構造を決定することができれば、その構造情報をもとにして、糖尿病や摂食代謝異常に対する新たな治療薬開発に寄与することが期待できる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度の結果から、グレリンO-アシルトランスフェラーゼ (GOAT) を精製するためには、精製プロトコルの最適化およびGOATを安定化する必要があることが考えられた。そこで当該年度は、グレリンO-アシルトランスフェラーゼ (GOAT) の安定化変異体のスクリーニングを行った。
安定化変異体を作成するにあたり、構造既知のファミリータンパク質のコンストラクトを調べたが、どのファミリータンパク質も野生型で構造決定されていた。そこでAlpha Fold2を用いた構造予測をおこなった。その結果、GOATは、そのほとんどが小胞体膜に埋没されていることが予測された。しかしN末端の8アミノ酸は特定の構造を取っておらず、この領域の欠失変異体によってGOATを安定化できる可能性が考えられた。一方でファミリータンパク質では、アミノ酸点変異による安定化を図られた例はなかったため、アミノ酸点変異の導入は検討しなかった。C末端にHisタグおよびGFPを付与したGOATのN末端4または8アミノ酸を欠失させた変異体コンストラクトを作製してExpi293細胞で発現させた。GOAT発現細胞をDDMで可溶化後、Niカラムを用いて簡易的に精製したのち、蛍光ゲル濾過クロマトグラフィーで展開した。その結果、2つの欠失変異体と野生型の単分散性に差がなかった。またNiカラム溶出液100 uLあたりのGFPカウントも野生型と比較して差がなかった。これらのことからN末端欠失変異体によるGOATの安定化は困難であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
変異体のスクリーニング結果が不良に終わったことと、共同研究で進めている国際共同研究強化 (B) のために3ヶ月間渡米していたため、予定していた精製バッファーの検討がほとんど行えなかったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
欠失変異体による安定化が見込まれなかったことから、野生型に絞って精製条件の検討を行う。まず、当該年度実施できなかった精製バッファーのスクリーニングを実施する。界面活性剤はDDM,GDN,MNGの三種類および還元剤の有無である。50 mLスケールで野生型GOATを発現させて、還元剤+/-の各界面活性剤バッファーを用いて可溶化したのち、GFPを指標にしたゲル濾過クロマトグラフィー (SEC) を行う。ピークの良好なものが複数得られた場合には、一定時間熱処理して、熱安定性の高いものを優先する。精製バッファーを決定することができれば、発現スケールを200 mLに上げてNi精製およびSECによりGOATを精製してクライオ電子顕微鏡観察サンプルを作製する。
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