神経軸索性インポーチンによる細胞質ダイニン制御機構の解明
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22K06220
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44010:Cell biology-related
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
水野 克俊 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (00777774)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | インポーチン / 神経軸索 / 細胞質ダイニン / ダイニン |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、インポーチン分子が神経細胞において核移行とは異なる機能、特に軸索輸送と細胞遊走について、分子モーターである細胞質ダイニン・キネシンとどのように関連しているかを解析する。手法としては、生化学的実験、顕微鏡によるイメージング実験、子宮内電気穿孔によるin vivoでの実験を組み合わせて実験を実施する。インポーチン分子におけるさまざまな変異が神経機能に及ぼす影響を検証することで、精神・神経疾患の病因の新たな分子機序の解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経細胞における細胞体から神経終末に至るまでの軸索輸送は記憶・学習・情動など高次脳機能において決定的な役割を果たす。インポーチンα (KPNA) やインポーチンβ(IPOβ)は代表的な古典的核移行因子であり、細胞質から核内への基質の輸送により様々なシグナルを核内へと伝える機能を持つ。近年、多様な精神疾患に核移行因子が関与することが報告されている。また、ストレス顆粒や凝集体の解消にインポーチンがシャペロンとして機能するなど、インポーチンが核移行以外の機能を有する多機能因子であることが明らかとなりつつある。本研究で代表者らは神経軸索中のKPNA1と分子モーターであるキネシンや細胞質ダイニン（以下ダイニンと呼称）との関係に着目し、核移行とは異なるインポーチンの神経軸索における機能の解析を目指した。
ラット、マウス神経生化学的解析の結果、神経軸索抽出物に多くの核移行関連因子が含まれていることが明らかとなった一方で、KPNAとIPOB1などの相互作用は、細胞質と軸索など神経突起では異なる可能性も示唆された。蛍光タンパク質との融合KPNA1やIPOB1を作成し、一次培養の神経細胞においてライブイメージングを行った。その結果、インポーチン分子が軸索で活発に輸送を受け、移動することが明らかとなった。一方で、インポーチン分子同士の相互作用は生化学的解析で示されたのと同様、細胞質では異なる可能性を支持した。同様の結果は、分子同士の近接性を評価するProximity Ligation Assayでも確認された。更に、疾患と関連する変異を有するKPNA1も検討したところ、特異的な局在を示すことができたことに加え、配列の改変によって改善させることができることが明らかとなった。以上の結果は核移行とは異なる軸索におけるインポーチンの機能と、疾患の原因を考える上で非常に重要な知見である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの実験で、実験の実施に必要なマウス後根神経節細胞 (DRG)の一次培養および遺伝子導入の系、ならびにライブイメージングを行うための共焦点顕微鏡およびFRAP装置の準備が完了し、すでに実験を開始している。また、本年からインポーチン分子同士の相互作用を直接的に検証するためのProximity Ligation Assay (PLA)の実験系も導入し、確立している。観察の結果、KPNA1を含む多くのインポーチン分子が軸索を活発に輸送されている様子をイメージングすることができた。インポーチンαとインポーチンβ分子の同時観察、さらにダイニン中間鎖やダイナクチン構成因子などとの同時観察からも、動態や軸索での分子間相互作用についても知見が得られた。また、PLAの結果からも細胞質と軸索で異なる分子間相互作用が存在する可能性が示唆された。さらに、疾患と関連する変異をいれたKPNA1の解析を行った結果、異常な局在と動態を示すことが判明した。現在は、これらのデータの蓄積ならびにラットの大腿神経をモデルとした、免疫沈降/プルダウン実験とLC-MS/MSによる質量分析を含む生化学的解析を進めているところである。本研究成果に関する論文を執筆し、現在投稿中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度である今年は、論文の投稿と掲載を目的とする。そのための論文の執筆はすでに完了し、投稿中であるが、今後の発展性も見越して、さらに予備的な実験を複数計画する。
Proximity Ligation Assayの系をさらに発展させ、核内外でのKPNA1相互作用候補因子との近接性を評価する。加えて、分子間での相互作用を質量分析で解析するのに有効な、ビオチン近接標識による質量分析の解析を行う。そのために、近接ビオチン標識用のコンストラクトにKPNA1を連結する。KPNA1の多機能性から、細胞内の局在の違いが重要となる。核内にKPNA1は集積することが知られるが、軸索局在性のKPNA1の分子複合体を解析するには、核内KPNA1からの持ち込みを排除する必要がある。そこで、核外移行配列を付加した近接標識コンストラクトを作成し、コントロールと比較することで軸索特異的なKPNA1分子複合体を詳細に解析する。以上の実験を加えることで、神経細胞軸索局在性のKPNA1の分子生物学的意義をより詳細に明らかにしていきたい。
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Report
(2 results)
Research Products
(12 results)
