| Project/Area Number |
22K06296
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44040:Morphology and anatomical structure-related
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
山口 陽子 島根大学, 学術研究院農生命科学系, 助教 (70801827)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今野 紀文 富山大学, 学術研究部理学系, 講師 (50507051)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 後葉ホルモン / GPCR / Gタンパク質選択性 / メダカ / 分子進化 / 構造機能連関 / 遺伝子編集 |
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| Outline of Research at the Start |
脊椎動物の下垂体後葉ホルモンは強力な抗利尿作用をもち、乾燥した陸上環境への適応に必須である。この抗利尿作用を媒介するV2a型受容体（V2aR）の分子・機能進化は、我々の環境適応能力の成り立ちを理解する上で重要な課題だが、詳細は不明である。本研究ではV2aRとその祖先型分子であるV2b型受容体（V2bR）に着目し、モデル生物のメダカを用いた実験で、V2bRからV2aRへの進化を人為的に再現する。これによりV2aRの進化過程とその影響について、分子～個体までのレベルで包括的に検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類の脳下垂体後葉から分泌されるホルモン・バソプレシン（VP）と、その非哺乳類ホモログであるバソトシン（VT）は、複数のGタンパク質共役型受容体を介して多彩な機能を発揮する。特に有名なのが腎臓での水分の再吸収を促す作用（抗利尿作用）である。この抗利尿作用を司るV2a型受容体（V2aR）は、そのシグナリング特性において他のVP/VT受容体と一線を画す；V2aRはGsと共役して細胞内cAMP濃度を上昇させるのに対し、その祖先型分子であるV2b型受容体（V2bR）を含む他のVP/VT受容体はすべてGqと共役し、Ca2+を用いて情報を伝達する。この違いの原因と影響、言い換えれば「V2aR出現の経緯」は、VP/VT系の進化に関する大きな謎として注目されてきた。本研究では、①V2aRとV2bRそれぞれのシグナリング特性を決定するアミノ酸配列モチーフを特定し、②得られた結果を基に遺伝子組換えメダカを作成することで、V2aRの分子進化を再現し、それがVP/VT系の機能進化にもたらした影響について検証することを目的とする。
これまでに、メダカV2aRとV2bRの配列を一部入れ替えたキメラ受容体を複数作成した。また、当初の予定にはなかったメダカV1aR（Ca2+タイプ）とネッタイツメガエルの受容体も比較対象として加え、各受容体のシグナリング特性についてin vitroでの解析を進めてきた。しかし現状では、野生型V2aR・V2bRのシグナリング特性に明確な違いが見られないという問題が発生しており、複数回の追試を重ねたが解決に至っていない。このため現在は、異なる実験系での検証を急いでいる（「今後の研究の推進方策」を参照）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初の予定と異なる実験系の構築が必要となったため（「研究実績の概要」および「今後の研究の推進方策」を参照）。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでは、全反射照明下でのFRET計測および電気生理学的解析により、受容体のシグナリング特性を評価しようと試みてきた（生理学研究所の共同利用研究制度により実施）。しかし同実験系では、度重なる追試にもかかわらず、「そもそも（キメラ受容体の対照群となるべき）野生型V2aR・V2bRのシグナリング特性に明確な差異が見られない」という根本的な問題が発生した。先行研究ならびに予備実験（主として蛍光・発光アッセイを採用）においては、VP/VT受容体サブタイプ間のシグナリング特性の違いが明確かつ再現性良く示されていることから、上記の結果には疑問が残る。いずれにせよ、このままでは本研究の目的を達成することは困難なため、比較のためにも、異なる実験系での検証が必要と判断した。
今後、Gsとの共役（cAMPシグナリング）に関しては組換えルシフェラーゼによる発光アッセイを、Gqとの共役（Ca2+シグナリング）に関してはTGFα切断アッセイを用いて検証する。後者は東北大学のグループにより近年開発された比色分析法である（*）。すでに実験系の構築に着手しており、2024年度前半にはin vitroでの検証を完了し、年度内に遺伝子組換えメダカの作成に着手することを予定している。
*Inoue et al. (2012) Nature Methods, 9, 1021-1029. DOI: 10.7875/first.author.2012.125
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