| Project/Area Number |
22K06315
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44050:Animal physiological chemistry, physiology and behavioral biology-related
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| Research Institution | Nara Women's University |
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Principal Investigator |
杉浦 真由美 奈良女子大学, 自然科学系, 教授 (60397841)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
臼杵 克之助 大阪公立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (30244651)
春本 晃江 奈良女子大学, ダイバーシティ推進センター, 特任教授 (80198936)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2025: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | 繊毛虫 / 交配フェロモン / 接合 / 有性生殖 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、原生生物繊毛虫の中でも進化的に初期に分岐したグループと考えられているブレファリズマ属（繊毛虫類異毛綱）に注目し、より原始的な繊毛虫にみられる独創的な有性生殖（接合）の分子機構を探る。ブレファリズマの接合には、繊毛虫の中で唯一糖タンパク質とアミノ酸誘導体を交配フェロモンとして用いるなど多くの独特な特徴がみられる。本研究では、交配フェロモン受容体や接合誘導に関連する新たな因子の同定を行い、交配フェロモンの受容機構の解明を目指す。また、ブレファリズマ属の種間認識に関わる交配フェロモンの多様性を探る。
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核単細胞生物である繊毛虫は、富栄養条件下では二分裂を繰り返して増殖するが、貧栄養条件下に置かれると分裂を停止し有性生殖（接合）を開始する。ブレファリズマ属は、繊毛虫類の中でも比較的初期に分岐した原始的なグループと考えられており、交配フェロモンや接合過程に独特な特徴をもつ。本研究は、二種類の接合型（Ⅰ型、Ⅱ型）と交配フェロモン（ガモン1、ガモン2）をもつブレファリズマを用いて繊毛虫の接合のより原始的な分子機構を探ることを目的としている。ブレファリズマの接合開始の鍵となる交配フェロモンの受容体の探索、ブレファリズマ属の種間認識に関わるガモン1の多様性の探究、接合型特異的な発現を示す遺伝子に注目した新たな接合関連因子の探索に取り組み、令和6年度は主に以下の成果を得た。
【交配フェロモン受容体候補の探索】昨年度、Ⅱ型細胞がもつガモン1受容体候補として網羅的解析結果をもとに選別した、Ⅱ型細胞で高発現している可能性がある膜タンパク質候補について、接合誘導時や一連の接合過程における発現解析を行った。Ⅰ型細胞がもつガモン2受容体に関しては、ガモン2受容能に差があるⅠ型細胞におけるビオチン標識ガモン2の局在解析を行い、ガモン2受容体特異的なシグナルの可能性があるシグナルについてより詳細な検証を行った。
【ブレファリズマ属内の交配フェロモンの多様性の検討】B. hyalinumのガモン1相同遺伝子の発現の有無を明らかにするため、ガモン2で接合誘導したⅠ型細胞におけるRNA、タンパク質レベルの発現を調べた。
【接合型特異的にはたらく接合関連因子の探索】Ⅰ型細胞特異的に発現し、接合過程に関与している可能性が考えられた候補遺伝子の推定アミノ酸配列をもとにペプチド抗体を作製した。また、Ⅱ型細胞特異的に高発現している可能性のある配列を選別し、候補遺伝子の配列決定や発現解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和6年度は、以下の各研究課題について着実に検証を進め新たな知見を得た。
【交配フェロモン受容体候補の探索】Ⅱ型細胞がもつガモン1受容体候補の探索を目的として昨年度選別した膜タンパク質候補について、接合誘導時や接合過程における発現解析を行った結果、接合誘導時の飢餓条件にあるⅡ型細胞でとくに高発現している可能性が示唆された。Ⅰ型細胞がもつガモン2受容体に関しては、本研究で合成したビオチン標識ガモン2を用いてガモン2受容能に差があるⅠ型細胞における局在解析を行い、これまでに注目していたシグナルがより確実にガモン2受容体特異的なシグナルであることを示した。本研究で得られたブレファリズマのガモン受容体に関する成果は、まだ未解明な点が多い繊毛虫の接合開始機構の仕組みやその多様性を探究する上で、非常に貴重な知見となり得ると考えている。
【ブレファリズマ属内の交配フェロモンの多様性の検討】他種とは異なる独特な構造をもつB. hyalinumのガモン1相同遺伝子について、ガモン2による接合誘導時にRNA発現量が増加することを確認した。ガモン2処理によって発現が増加するタンパク質に注目することで、実際にガモン1タンパク質が作られているか検証を進めている。
【接合型特異的にはたらく接合関連因子の探索】昨年度までに単離した、Ⅰ型細胞特異的に発現する接合関連遺伝子候補について、その推定アミノ酸配列をもとにペプチド抗体を作製した。現在、抗体の特異性を検証している。また、網羅的発現解析結果をもとにⅡ型細胞特異的に高発現している可能性のある配列を選別した。それらの遺伝子の全長配列を決定し、接合誘導時や接合過程における発現解析を行った。このように、Ⅰ型・Ⅱ型の両接合型細胞において特異的に発現する遺伝子に注目し、それらの発現パターンをもとに接合に関与している可能性の検証を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに得られた成果をもとに、令和7年度は以下の計画に基づき研究を進める。
【交配フェロモン受容体候補の探索】ガモン1受容体候補として選別したⅡ型細胞特異的な発現を示す膜タンパク質候補について、Ⅱ型細胞における全長配列を決定し、接合誘導時や接合過程における発現解析結果の再現性を調べる。また、推定アミノ酸配列をもとにペプチド抗体を作製し、タンパク質レベルの発現解析や細胞内局在解析を試みる。さらに、これまでに本研究で行った生化学的アプローチによるガモン1受容体候補の探索結果も考慮して、注目している膜タンパク質候補がガモン1受容体である可能性を検証する。ガモン2受容体の探索に関しては、ビオチン標識ガモン2を用いて本研究で明らかにしたガモン2受容体の局在解析の結果をまとめ、論文を投稿する。
【ブレファリズマ属内の交配フェロモンの多様性の検討】引き続き、ガモン2処理したB. hyalinumで発現が増加する分泌タンパク質の検出を行い、質量分析によってB. hyalinumのガモン1相同遺伝子から実際にガモン1タンパク質が作られているかを検証する。
【接合型特異的にはたらく接合関連因子の探索】Ⅰ型細胞特異的に発現する接合関連遺伝子候補について、作製したペプチド抗体の特異性を検証し、タンパク質レベルでの発現解析や細胞内局在解析を試みる。また、Ⅱ型細胞特異的に高発現している可能性のある遺伝子として単離した候補遺伝子について、引き続き詳細な発現解析を行い接合に関与している可能性を検証する。
本研究で計画していた上記3つの課題において興味深い多くの結果が得られたため、これら3課題を中心に進めることとし、残りの【ガモン2の生合成に関わる酵素の同定】については、網羅的解析データをもとにトリプトファン誘導体であるガモン2の生合成に関わる可能性のある酵素のリスト化に取り組む。
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