自然免疫に重要なcGASを活性化するZCCHC3の作用機構の解明
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22K06546
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
水口 峰之 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 教授 (30332662)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
帯田 孝之 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 准教授 (30578696)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | ZCCHC3 / cGAS / タンパク質 / 自然免疫 / DNA結合 / ゲルシフトアッセイ / DNA結合タンパク質 / 立体構造 |
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| Outline of Research at the Start |
DNA結合タンパク質のZCCHC3は、自然免疫に重要なcGASと共局在し、cGASを活性化する。しかしながら、ZCCHC3がDNAやcGAS分子とどのように相互作用し、なぜcGASを活性化するのかについての詳細なメカニズムは不明なままである。さらに、ZCCHC3がどのようなDNAを認識するのかや、その結合がどの程度の強さなのかも明らかにされていない。本研究では、等温滴定型カロリメトリーなどの物理化学的解析や、X線結晶構造解析などの立体構造解析を行うことで、ZCCHC3によるDNA結合とcGASの活性化を定量的にかつ原子レベルで解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Cyclic GMP-AMP synthase（cGAS）は、細胞質内に存在するDNAセンサーであり、ATPとGTPから2'3'-cyclic GMP-AMP（2'3'-cGAMP）を合成し、cGAS/STING経路を介してI型インターフェロン産生を誘導する。一方、ZCCHC3 は二本鎖DNAに結合してcGASの活性を増強するcGAS制御因子である。本研究では、自然免疫におけるcGASとZCCHC3の役割についての知見を得るために、ZCCHC3とcGASのDNA結合、およびcGASの2'3'-cGAMP産生機構について研究する。
ZCCHC3と一本鎖DNAおよび二本鎖DNAとの結合を調べ、ZCCHC3は二本鎖DNAよりも一本鎖DNAに強く結合することを明らかにした。同様に、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAとcGASの結合を調べたところ、cGASも二本鎖DNAよりも一本鎖DNAに強く結合した。先行研究により、一本鎖DNAはcGASを活性化しないことが示されているので、一本鎖DNAの結合はcGASの活性化に必要な構造変化を引き起こさないと考えられた。また、cGASが産生する2'3'-cGAMP量をHPLCで検出して定量化し、2'3'-cGAMPの産生速度を求めた。この実験では、70ヌクレオチドの一本鎖HIV-1 SL2 DNA存在下で2'3'-cGAMP産生速度を調べ、枯草菌由来の二本鎖DNA存在下での2'3'-cGAMP産生速度と比較した。その結果、一本鎖のHIV-1 SL2 DNAによるcGASの活性化は、枯草菌由来の二本鎖DNAによる活性化と比較して著しく弱いことを明らかにした。さらに、G3 Y-form DNAの5'末端と3'末端のグアニンがシトシンに変異すると、cGASとY-form DNAの結合が低下し、cGASの2'3'-cGAMP産生が低下することを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ZCCHC3およびcGASが、どちらも二本鎖DNAよりも一本鎖DNAに強く結合することを示すとともに、Y-form DNAによるcGASの活性化が、Y-form DNAとの結合の強さに依存することを示したことから、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
cGASによる2'3'-cGAMP産生がZCCHC3の濃度に依存するかを調べ、どのような条件でZCCHC3がcGASを活性化するのかを明らかにする。
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Report
(2 results)
Research Products
(1 results)
