| Project/Area Number |
22K06546
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
水口 峰之 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 教授 (30332662)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
帯田 孝之 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 准教授 (30578696)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | ZCCHC3 / cGAS / タンパク質 / 自然免疫 / 2'3'-cGAMP / DNA結合 / ゲルシフトアッセイ / DNA結合タンパク質 / 立体構造 |
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| Outline of Research at the Start |
DNA結合タンパク質のZCCHC3は、自然免疫に重要なcGASと共局在し、cGASを活性化する。しかしながら、ZCCHC3がDNAやcGAS分子とどのように相互作用し、なぜcGASを活性化するのかについての詳細なメカニズムは不明なままである。さらに、ZCCHC3がどのようなDNAを認識するのかや、その結合がどの程度の強さなのかも明らかにされていない。本研究では、等温滴定型カロリメトリーなどの物理化学的解析や、X線結晶構造解析などの立体構造解析を行うことで、ZCCHC3によるDNA結合とcGASの活性化を定量的にかつ原子レベルで解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Cyclic GMP-AMP synthase（cGAS）は、細胞質内に存在するDNAセンサーであり、ATPとGTPから2'3'-cyclic GMP-AMP（2'3'-cGAMP）を合成し、cGAS/STING経路を介してI型インターフェロン産生を誘導する。一方、ZCCHC3は二本鎖DNAに結合してcGASの活性を増強するcGAS制御因子である（Lian et al., Nat Commun. 2018, 9, 3349）。本研究では、自然免疫におけるcGASとZCCHC3の役割についての知見を得るために、ZCCHC3とcGASのDNA結合、およびcGASの2'3'-cGAMP産生機構について研究する。
ZCCHC3がcGASの活性を増強するかどうかを調べるために、ZCCHC3存在下においてcGASの2'3'-cGAMP産生を調べた。cGASの濃度を500 nM、二本鎖DNAの濃度を1 μMとし、37℃で酵素反応を行った。その結果、200 nMのZCCHC3存在下において2'3'-cGAMP産生量が15%低下し、400 nMのZCCHC3存在下においても20%低下した。以上の結果から、ZCCHC3はcGASの活性を減弱させる効果があることが示された。さらに、ZCCHC3のN末端領域（1-165残基）の発現・精製を行い、N末端領域存在下におけるcGASの2'3'-cGAMP産生を調べたところ、400 nMのN末端領域が存在する条件で、cGASの2'3'-cGAMP産生は90%以上低下した。一方で、ZCCHC3のC末端領域（160-403残基）存在下の2'3'-cGAMP産生量は、全長のZCCHC3が存在するときと差がなかった。以上より、ZCCHC3の1-165残基からなるN末端領域が、cGASの2'3'-cGAMP産生を抑制する効果があると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ZCCHCがcGASの2'3'-cGAMP産生を抑制する効果があることを示し、さらにZCCHC3のN末端領域が重要であることを示したことから、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ZCCHC3はcGASの活性を増強するcGAS制御因子であると報告されている（Lian et al., Nat Commun. 2018, 9, 3349）。しかし、今回の研究では、ZCCHC3がcGASの活性を抑制することが示された。我々の研究では、cGASによって産生された2'3'-cGAMPをHPLCで定量化している。今後は、HPLC以外の手法でcGASの活性を測定し、さらなる検証を行う必要がある。
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