不死化したヒト脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清による実験的自己免疫性神経炎の治療効果

• Project/Area Number: 22K07504
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 52020:Neurology-related
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 宮川 聡美 東京医科大学, 医学部, 兼任助手 (40931324)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 善本 隆之 東京医科大学, 医学部, 教授 (80202406)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: ヒト乳歯歯髄幹細胞 / 培養上清 / 実験的自己免疫性神経炎 / シュワン細胞 / ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞

Outline of Research at the Start

今日、間葉系幹細胞を用いた細胞療法が盛んであるが、その細胞培養上清（CM）の投与でも効果があり、免疫拒絶を考慮する必要もなく、安全性も高いため注目されている。当研究室では、最近、ヒト脱落乳歯由来の歯髄幹細胞（SHED）に不死化遺伝子を導入し安定的に高い増殖性を示す細胞株を作製した。歯髄幹細胞は、元々神経系由来のため、本研究では、まず、末梢神経障害の病気であるギラン・バレー症候群のマウスモデルである実験的自己免疫性神経炎モデルマウスを用いて、SHED-CMの治療効果とその作用機序について明らかにし、さらに、他の末梢神経障害の病気への応用の可能性についても検討する。

Outline of Annual Research Achievements

2023年度はマウスシュワン細胞株IMS32を用いたSHED-CMの作用機序の検討を行った。
①SHED-CMの蛋白質分子の関与：IMS32細胞に、無血清下SHED-CMまたはコントロール培地を加えると、SHED-CMの容量依存的に細胞増殖が増強された。そこで、SHED-CM中のどの分子が関与しているかを調べるために、可能性の高い10種類以上の組換えサイトカインを選びIMS32細胞に加えると、HGFとbFGF、NRG1で細胞増殖を増強し、さらに、SHED-CMによる細胞増殖の増強が、それぞれの抗体でブロックされることがわかった。さらに、SHED-CMでIMS32細胞を刺激すると、c-METやErbB2-4、その下流のERKやAKTのリン酸化を誘導し、SHED-CMおよび上記のサイトカインは、いずれもシュワン細胞の分化に重要な転写因子EGR2の発現も増強した。
②SHED-CMのエクソソームの関与：SHED-CM中のエクソソームからRNAを抽出し、GeneChip miRNA Arrayを用いて網羅的に発現解析を行ったところ、アレイに用いた6599種類のmicroRNAの内、845個のmicroRNAが検出された。その中には、シュワン細胞の機能に関与していそうなmicroRNAも含まれていた。そこで、SHED-CMを超遠心機を用いて分離後、上清を蛋白質、沈渣をエクソソーム分画に分けて、まず、NanoSightにより粒子サイズが平均100 nmであることや、エクソソームのマーカー分子CD63とCD81の抗体を用いたウエスタンブロット解析より、両者が綺麗に分離されていることがわかった。そこで、分離前のSHED-CMとコントロール培地、両分画をIMS32細胞に加え細胞増殖を調べると、エクソソーム分画では増殖への影響が殆どなく、蛋白質分画で分離前と同レベルに、細胞増殖を増強した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

不死化したヒト脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清（SHED-CM）による実験的自己免疫性神経炎(EAN)の抑制効果とその作用機序が明らかになってきているので、ほぼ計画の予定通り進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

2024年度は、当初は、SHED-CMによるT細胞活性化の抑制効果について調べる予定であったが、SHED-CMのシュワン細胞や神経細胞への効果の方が大きいと考え、さらに詳細に調べ、そこまでで論文に纏めることにし、T細胞活性化の抑制効果については先送りにすることにした。
①SHED-CMによるシュワン細胞のミエリン化増強効果：既報に従い、マウス坐骨神経よりシュワン細胞を分離後、初代培養を行う。この初代培養シュワン細胞、または、ヒトテロメラーゼ遺伝子を導入し株化したhTERT-シュワン細胞株（ATCCより購入）を培養し、そこへSHED-CMおよびコントロール培地を加え、経時的に、細胞を固定し免疫蛍光染色と、細胞溶解液を調製しウエスタンブロット解析により、成熟シュワン細胞への分化マーカーであるミエリン塩基性蛋白質（MBP）やMyelin protein zero（P0）、EGR2の発現増強を調べる。次に、EGR2発現誘導の重要性を明らかにするため、EGR2特異的siRNAおよびコントロールsiRNAを遺伝子導入し、EGR2発現の低下を確認後、成熟シュワン細胞への分化への影響を調べる。
②SHED-CMによる神経細胞の神経突起伸張増強効果：神経成長因子（NGF）の添加により神経突起伸張能を有するラット褐色細胞腫PC12細胞に、SHED-CM、または、コントロール培地、NGFを加え、48時間後、細胞形態を写真に撮り、画像解析ソフト（ImageJ）を用いて神経突起の長さを定量し、神経突起伸張能への効果を検討する。SHED-CMに神経突起伸張効果が見られれば、それに関与していそうなNGFやHGF、bFGF、NRG1などのサイトカインに対する抗体を加え、その神経突起伸張能の増強効果がブロックできるか検討し、その作用機序を明らかにする。

Research Products

• [Journal Article] A Promising Needle-Free Pyro-Drive Jet Injector for Augmentation of Immunity by Intradermal Injection as a Physical Adjuvant (2023)
  • Author(s): Jukito Sonoda,Izuru Mizoguchi,Shinya Inoue,Aruma Watanabe,Ami Sekine,Miu Yamagishi,Satomi Miyakawa,Natsuki Yamaguchi,Eri Horio,Yasuhiro Katahira,Hideaki Hasegawa,Takashi Hasegawa,Kunihiko Yamashita and Takayuki Yoshimoto
  • Journal Title: Int J Mol Sci. Volume: 24 Issue: 10 Pages: 9094-9094
  • DOI: 10.3390/ijms24109094
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] State-of-the-Art Cancer Immunotherapies. (2023)
  • Author(s): Nagase H, Kato T, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Int J Mol Sci. Volume: 25(5) Issue: 5 Pages: 2532-2532
  • DOI: 10.3390/ijms25052532
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Protective effects of conditioned media of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous teeth on pressure ulcer formation (2023)
  • Author(s): Katahira Yasuhiro、Murakami Fumihiro、Inoue Shinya、Miyakawa Satomi、Sakamoto Eri、Furusaka Yuma、Watanabe Aruma、Sekine Ami、Kuroda Masahiko、Hasegawa Hideaki、Mizoguchi Izuru、Yoshimoto Takayuki
  • Journal Title: Frontiers in Immunology Volume: 13 Pages: 1010700-1010700
  • DOI: 10.3389/fimmu.2022.1010700
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Potent antitumor effects of the conditioned medium of bone marrow-derived mesenchymal stem cells via IGFBP-4. (2023)
  • Author(s): Furusaka Y, Inoue S, Mizoguchi I, Hasegawa H, Katahira Y, Watanabe A, Sakamoto E, Sekine A, Miyakawa S, Umezu T, Owaki T, Yoneto T, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: in press Issue: 6 Pages: 2499-2514
  • DOI: 10.1111/cas.15789
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Chemical- and Drug-Induced Allergic, Inflammatory, and Autoimmune Diseases via Haptenation. (2023)
  • Author(s): Sakamoto E, Katahira Y, Watanabe A, Furusaka Y, Sekine A, Yamagishi M, Sonoda J, Miyakawa S, Inoue S, Hasegawa H, Yo K, Yamaji F, Toyoda T, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Biology (Basel) Volume: 12(1) Issue: 1 Pages: 123-123
  • DOI: 10.3390/biology12010123
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Induction of potent antitumor immunity by intradermal <scp>DNA</scp> injection using a novel needle‐free pyro‐drive jet injector (2022)
  • Author(s): Inoue Shinya、Mizoguchi Izuru、Sonoda Jukito、Sakamoto Eri、Katahira Yasuhiro、Hasegawa Hideaki、Watanabe Aruma、Furusaka Yuma、Xu Mingli、Yoneto Toshihiko、Sakaguchi Naoki、Terai Kazuhiro、Yamashita Kunihiko、Yoshimoto Takayuki
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 114 Issue: 1 Pages: 34-47
  • DOI: 10.1111/cas.15542
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Topical application of Cha-koji, the green tea leaves fermented with Aspergillus lunchuensis ver kawachii kitahara, on the skin promotes acute cutaneous wound healing in mice. (2024)
  • Author(s): Katahira Y, Watanabe A, Miyakawa S, Hasegawa H, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第52回日本免疫学会総会・学術集会
• [Presentation] Inhibition of melanogenesis by conditioned medium of an immortalized stem cell line from human exfoliated deciduous teeth through possibly Wnt5a-mediated suppression of Wnt signaling. (2024)
  • Author(s): Sekine A, Katahira Y, Watanabe A, Miyakawa S, Hasegawa H, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第52回日本免疫学会総会・学術集会
• [Presentation] 新しいヒト臍帯・胎盤・羊膜の抽出液による化学療法誘発性末梢神経障害モデルマウスの末梢 神経障害の軽減 (2024)
  • Author(s): 善本隆之、堀尾江里、長谷川英哲、片平泰弘、宮川聡美、米戸敏彦、池田伸一郎、穴水弘光、松本浩彦、溝口 出
  • Organizer: 第23回日本再生医療学会総会
• [Presentation] Conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous teeth inhibit melanogenesis by suppressing Wnt signaling via Wnt5a. (2023)
  • Author(s): Inoue S, Sekine A, Katahira Y, Yamagishi M, Sonoda J, Watanabe A, Miyakawa S, Hasegawa H, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: JSICR/MMCB 2023 Joint Symposium
• [Presentation] イミキモド誘導性乾癬モデルにおけるストレス応答性MAPキナーゼASK1の役割とその作用機序 (2023)
  • Author(s): 長谷川英哲、渡邉有麻、溝口 出、片平泰弘、関根碧水、山岸美宇、園田寿希心、宮川聡美、前田龍郎、原田和俊、大久保ゆかり、善本隆之
  • Organizer: 第38回日本乾癬学会総会・学術大会
• [Presentation] Protective effect of conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous tooth on the peripheral neuropathy of experimental autoimmune neuritis. (2022)
  • Author(s): Hasegawa H, Sakamoto E, Katahira Y, Miyakawa S, Murakami F, Inoue S, Watanabe A, Furusaka Y, SekineA, Owaki T, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: JSICR/MMCB 2022 Joint Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 不死化したヒト脱落乳歯歯髄幹細胞の培養上清投与による実験的自己免疫性神経炎の治療効果 (2022)
  • Author(s): 善本隆之、長谷川英哲、片平泰弘、井上槙也、古阪悠馬、坂本恵梨、渡邉有麻、宮川聡美、大脇敏之、溝口 出
  • Organizer: 第21回日本再生医療学会総会
• [Presentation] 不死化したヒト脱落乳歯歯髄幹細胞（SHED-CM）培養上清の褥瘡モデルマウス皮膚潰瘍に対する治療効果 (2022)
  • Author(s): 片平泰弘、長谷川英哲、井上槙也、古阪悠馬、坂本絵梨、渡邉有麻、関根碧水、宮川聡美、溝口 出、善本隆之
  • Organizer: 第21回日本再生医療学会総会
• [Presentation] Inhibitory effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on tumor growth and its possible molecular mechanism. (2022)
  • Author(s): Furusaka Y, Katahira Y, Hasegawa H, Umezu T, Mizoguchi I, Yoneto T, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous tooth exhibit protective effect on the peripheral neuropathy of experimental autoimmune neuritis. (2022)
  • Author(s): Sakamoto E, Hasegawa H, Katahira Y, Miyakawa S, Watanabe A, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第51回日本免疫学会総会・学術集会
• [Patent(Industrial Property Rights)] 不死化間葉系幹細胞の上清を含む末梢神経障害治療用医薬組成物、及びその組成物を有効成分とする医薬製剤 (2023)
  • Inventor(s): 善本隆之、長谷川英哲、溝口出、山下靖弘
  • Industrial Property Rights Holder: 善本隆之、長谷川英哲、溝口出、山下靖弘
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2023
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] 不死化間葉系幹細胞の上清を含む末梢神経障害治療用医薬組成物、及びその組成物を有効成分とする医薬製剤 (2022)
  • Inventor(s): 善本隆之、溝口出
  • Industrial Property Rights Holder: 善本隆之、溝口出
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2022-031332
  • Filing Date: 2022