双極性障害における細胞内カルシウム恒常性異常と時計遺伝子の関連解析

• Project/Area Number: 22K07613
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 52030:Psychiatry-related
• Research Institution: University of Yamanashi
• Principal Investigator: 上村 拓治 山梨大学, 大学院総合研究部, 医学研究員 (60377497)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 双極性障害 / 時計遺伝子 / PER2 / NR1D1 / GSK3β / リチウム / CLOCK / BMAL1 / カルシウムチャネル / 細胞内ストレスシグナル

Outline of Research at the Start

双極性障害患者では、細胞内ストレスシグナル伝達を担うカルシウムの恒常性異常を認め、『カルシウムチャネルの機能障害』が示唆されているが、双極性障害における躁、うつといった病相の周期的変化や日内変動といった特徴的な病態（『長期周期性を伴う概日リズム異常』）との関連性はまだ十分に解明されていない。そこで、①細胞内カルシウムの恒常性異常、②気分安定薬であるリチウムの作用機序（GSK3β阻害作用）、③周期性の長期化を伴う時計遺伝子の発現変動、これらを融合させた分子遺伝学・薬理学的機能解析を行うことによって、双極性障害の発症機序を解明することを目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

双極性障害患者では、細胞内ストレスシグナル伝達を担うカルシウムの恒常性異常を認め、『カルシウムチャネルの機能障害』が示唆されているが、双極性障害における躁、うつといった病相の周期的変化や日内変動といった特徴的な病態（『長期周期性を伴う概日リズム異常』）との関連性はまだ十分に解明されていない。本研究は、①細胞内カルシウムの恒常性異常、②気分安定薬であるリチウムの作用機序（GSK3β阻害作用）、③周期性の長期化を伴う時計遺伝子の発現変動、これらを融合させた分子遺伝学・薬理学的機能解析を行うことによって、双極性障害の発症機序を解明することを目的としている。
昨年度は、YKG-1細胞を用いて、1mM LiCl長期投与（7日間）時における概日リズムを担う時計遺伝子であるCLOCK、BMAL1の発現をqRT-PCRで評価し、CLOCKおよびBMAL1の発現は増加していることを認めた。また、RNAiベクターによってGSK3βの発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株では、BMAL1の発現は増加していたが、当初の予想と反して、CLOCKの発現量は減少しているといった知見を得た。
本年度は、昨年度に得られた知見の妥当性を検証するために、ヘテロダイマーを形成しているCLOCKとBMAL1とともに概日リズムの分子メカニズムを形成しているPER2およびNR1D1のの発現変動をqRT-PCRで評価した。1) YKG-1細胞において、1mM LiCl長期投与（7日間）した際、PER2の発現は減少し、NR1D1の発現は増加していた。
2) RNAiベクターによってGSK3βの発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株では、PER2の発現は増加し、NR1D1の発現は減少傾向を認めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年および本年度の研究結果より、1mM LiCl長期投与（7日間）によって、ヘテロダイマーを形成しているCLOCKとBMAL1だけでなく、これらの遺伝子とともに概日リズムの分子メカニズムを形成しているPER2およびNR1D1の発現も変動していた。また、GSK3βの発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株を用いた実験により、CLOCK、BMAL1だけでなく、PER2およびNR1D1の発現もGSK3βと関連することが示唆された。しかしながら、時計遺伝子群は生体の細胞と同様にYKG-1細胞を含む培養細胞においても、約24時間のリズムを刻んでいる。しかしながら、培養細胞は暗所や37度などの一定な環境のもとで維持・増殖しているため、個々の細胞が同調してリズムを刻んでいるとは限らない。そのため、1mM LiCl長期投与（7日間）におけるCLOCK、BMAL1、PER2、NR1D1の発現リズムを詳細に評価するためには、これらの統計遺伝子を同調させた上で、各遺伝子の周期性を含めた発現変動および相関を評価する必要性を認めた。現在、過去の文献を検索しながら、YKG-1細胞における時計遺伝子群の同調条件を検討中である。

Strategy for Future Research Activity

１）YKG-1細胞における時計遺伝子群の同調条件を検討し、CLOCK、BMAL1、PER2、NR1D1の周期性を含めた発現変動を確認する。
２）CLOCK、BMAL1、PER2、NR1D1の周期性を含めた発現変動を確認した後、1mM LICl７日間投与後の各遺伝子の周期性を含めた発現変動を評価する。
３）GSK3βの発現が安定にノックダウンしているYKG-1細胞株についても、細胞を同調させた上で、CLOCK、BMAL1、PER2、NR1D1の周期性を含めた発現変動を確認する。
４）CACNA1Cが安定にknock downしているYKG-1細胞株［申請者によって既に作成済み］を用いて、上記と同じ実験を行い、CACNA1Cと時計遺伝子群の遺伝子間相互作用を評価する。