動脈硬化と肺動脈性肺高血圧症に共通した治療標的転写因子の検証と新規標的因子の同定

• Project/Area Number: 22K08136
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53020:Cardiology-related
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 早川 朋子 自治医科大学, 医学部, 助教 (30420821)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今井 靖 自治医科大学, 医学部, 教授 (20359631)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: 大動脈 / 肺動脈 / 肺動脈性肺高血圧症 / 動脈硬化 / 血管平滑筋細胞 / 肺動脈性高血圧症 / 平滑筋 / 形質転換 / 転写因子

Outline of Research at the Start

肺動脈性肺高血圧症と動脈硬化は、平滑筋形質転換により血管収縮能が可逆的に消失した後、病勢増悪に伴い不可逆的に進行する。申請者らはヒストン修飾酵素Nsd1と下流の転写因子群（Meox2, etc）による形質転換誘導を発見し、PAH患者動脈平滑筋のMeox2発現上昇を見出した。以上よりNsd1-Meox2は動脈硬化のみならず、肺動脈平滑筋形質転換を惹起すると強く示唆する。
本研究はNsd1欠損マウスによりMeox2のPAH治療標的としての有効性を検証する。さらにNsd1欠損肺動脈平滑筋培養により、Meox2以外の標的転写因子を探索する。

Outline of Annual Research Achievements

肺動脈性肺高血圧症と動脈硬化は、平滑筋形質転換により血管収縮能が可逆的に消失した後、病勢増悪に伴い不可逆的に進行する。申請者らはヒストン修飾酵素Nsd1と下流の転写因子群（Meox2, etc）による形質転換誘導を発見し、PAH患者動脈平滑筋のMeox2発現上昇を見出した。以上よりNsd1-Meox2は動脈硬化のみならず、肺動脈平滑筋形質転換を惹起すると強く示唆する。本研究はNsd1欠損マウスによりMeox2のPAH治療標的としての有効性を検証する。さらにNsd1欠損肺動脈平滑筋培養により、Meox2以外の標的転写因子を探索する。PAHと動脈硬化は、平滑筋形質転換により血管収縮能が可逆的に消失した後、病勢増悪に伴い不可逆的に進行する。病態の主要因である平滑筋形質転換抑制は非常に困難であり、特に若年性の指定難病であるPAHの新規薬剤の開発は喫緊の課題である。
申請者らは動脈硬化で発見した形質転換促進機序; Nsd1-下流転写因子（Meox2, Egr3, Gata2, Pou3f3）と、PAHで発見したMeox2に着目した。本研究の目的は、Nsd1下流転写因子Meox2のPAHの治療標的としての有効性検証と、他の転写因子の探索である。Nsd1遺伝子欠損マウス (+/+, -/-)より肺動脈平滑筋細胞を培養が成功していない。また、Nsd1-Meox2が平滑筋形質転換によるPAH病態増悪を惹起するとの仮説に基づき、PAHモデルマウスにMeox2 siRNAをin vivoトランスフェクションを現在試みている。またNsd1遺伝子欠損マウス (+/+, -/-)のPAHモデルを現在作製中である。
予定していた実験で予定通り進まないものがあったため、他の方法を検討した。Nsd1欠損マウス由来大動脈、肺動脈の調整、細胞培養系の確立、FACSによる細胞分離、scRNA-seqを試みた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Nsd1遺伝子欠損マウス (+/+, -/-)のPAHモデルを現在作製中である。Nsd1-Meox2が平滑筋形質転換によるPAH病態増悪を惹起するとの仮説に基づき、PAHモデルマウスにMeox2 siRNAをin vivoトランスフェクションし病態改善効果を解析を試みたが成功していない。Nsd1遺伝子欠損マウス (+/+, -/-)より肺動脈平滑筋細胞を培養し、RNA seqを行う予定であったが、マウス肺動脈平滑筋細胞の培養が成功していない。この培養系確率が非常に困難であるため、他の方法を検討している。
予定していた実験で予定通り進まないものがあったため、他の方法を検討した。Nsd1欠損マウスから大動脈、肺動脈の調整を試みた。大動脈からの細胞調整は、使用酵素、処理時間と方法を検討した結果、ヒアルロニダーゼを37℃で50分間処理することで生存率の高い大動脈細胞の調整に成功した。しかし肺動脈細胞の調整はまだ成功していない。現在、ヒアルロニダーゼなどを用いた肺動脈からの細胞調整を検討中である。ついで、大動脈細胞を用いたFACSによる細胞分離を試みた。申請者はFACS使用経験がないため、自治医科大学共同実験センターにてFACS Aria使用の講習会を受講した。その後、HashTagを用いてscRNA-seqを行うために、大動脈細胞の表面抗原がHashTagに適応しているかをFACSを用いて確認したが、目的の表面抗原が大動脈細胞に存在していなかったため、大動脈細胞表面をビオチン化しHashTag付加を検討した。FACSでHashTag付加を確認したところ、95%以上の大動脈細胞でHashTag付加が確認された。現在、scRNA-seqの準備中である。

Strategy for Future Research Activity

Nsd1遺伝子欠損マウス (+/+, -/-)より肺動脈平滑筋細胞を培養し、RNA seqを行う。野生型に対しNsd1欠損で発現低下した転写因子を探索する(図2の手法で解析)。転写因子をそれぞれ平滑筋細胞でノックダウンし、平滑筋の機能回復が観察された転写因子を抽出する。最後に患者PAH肺動脈平滑筋のRNA seqのデータに基づき(Meox2同定; Table.1参照)、治療標的可能な転写因子を同定する。同定後はin vivoトランスフェクションし病態改善効果を解析する。
Nsd1-Meox2が平滑筋形質転換によるPAH病態増悪を惹起するとの仮説に基づき、PAHモデルマウスにMeox2 siRNAをin vivoトランスフェクションし病態改善効果を解析する。同時に、Nsd1欠損肺動脈平滑筋細胞により、Meox2以外の転写因子を同定し、PAH病態改善効果を検証する(①)。またPAH患者肺組織によるscRNA seqによる検証を行う。
Nsd1下流転写因子Meox2のノックダウン (in vitro)が平滑筋細胞形質転換を抑制した事実に基づき(図2, 7参照)、以下の実験を行う。Nsd1遺伝子欠損マウス (+/+, -/-)のPAHモデルを作製してMeox2のノックダウン (in vivo)を行い、形質転換に伴う肺動脈血管狭窄などの病態が改善されるかを検討する。PAHモデルは、モノクロタリン投与による炎症惹起、低酸素曝露＋SU5416投与による血管過収縮により作製する。In vivoノックダウンは、Meox2 siRNAとトランスフェクション試薬（In vivo jetPEI: 肺の導入効率が高い）を混合し静脈注射より導入する。導入の３週間後に組織染色・RNAの解析を行う。
Nsd1欠損マウス由来の大動脈細胞を用いてscRNA-seqを行う。肺動脈の細胞調整は未確立のため、確立を行う。