内在性ウイルス粒子を介した細胞間コミュニケーションとその癌進展への関わり

• Project/Area Number: 22K08801
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55020:Digestive surgery-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 西田 尚弘 大阪大学, 医学部附属病院, 特任講師(常勤) (50588118)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 浩文 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (30322184)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 上皮間葉移行 / 大腸癌 / ARC遺伝子 / 内在性レトロウイルス配列 / 上皮間葉転換

Outline of Research at the Start

ヒトゲノムには、５~８％の内在性レトロウイルス (Endogenous retrovirus: ERV) の配列が存在することが知られているが、それらの機能に関しては不明な点が多い。本研究では、これまでほとんどわかっていなかった内在性レトロウイルス粒子が関わる細胞間コミュニケーションとその癌進展機構への関わりを明らかにし、大腸癌を始めとする固形腫瘍における革新的な治療開発へと展開する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、主に神経系細胞に多く発現し、生理的にはシナプスにおける神経伝達に関わる遺伝子であるARC (Activity Regulated Cytoskeleton Associated Protein) の癌進展との関連を調べ、新たな治療開発に繋げることを目標としてきた。これまでの我々の研究から、ARC遺伝子は癌の浸潤・転移に重要な役割を果たす上皮間葉移行 (Epithelial-Mesenchymal Transition: EMT)の誘導に重要な働きをすることが明らかとなった。また、ARC遺伝子はその一部にウイルス粒子を形成するGag蛋白をコードする塩基配列を含むことがわかっており、再生されるウイルス粒子がARCの癌進展における機能にどのような影響を与えるかを調べることも本研究の趣旨である。これまでに、レンチウイルスを用いてARCの強制発現やノックダウンの発現操作を行った癌細胞を用いて、薬剤耐性や癌の浸潤能といった癌進展に関わる様々な機能解析を行うことで、ARCが、癌の浸潤や薬剤耐性に関わることを明らかにしてきた。
本年度は、ARCノックダウン大腸癌細胞株を用いた網羅的なトランスクリプトーム解析を行うことで、ARCによるEMT誘導において関わるシグナル伝達について、詳細に検討した。成果の一つとして、EMTにおいて重要な役割を果たすことが知られているTGF-β経路の中で、ARCが効果的に機能していることが示された。さらに、これまでのin vitroの実験に加え、実際の大腸癌臨床サンプルを用いてARCタンパクに対する特異的抗体を用いた免疫組織学的染色を行い、ARC遺伝子の発現状態とその臨床病理学的因子、さらには予後への関わりの検証を行ってきた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに、in vitroでARCの強制発現、発現抑制によって癌細胞における 上皮マーカーE-cadherinや間葉系マーカーZEB1などの細胞内での遺伝子発現の変化、並びに蛍光免疫染色を用いてARCタンパクの細胞内局在の変化を明らかにしてきた。本年度は、ARCのノックダウン細胞株を用いた網羅的トランスクリプトーム解析（RNA-seq解析）を行い、Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)を行うことにより、ARCによるEMT誘導にTGF-β経路が関わっていることを明らかにした。これを裏付けるように、サイトカインTGF-β暴露によってEMTが誘導された細胞株に対して、ARCの発現抑制を行うことで、EMTが抑制されることを、各種分子マーカーの解析から明らかにした。細胞の形態に関しても、EMTにより紡錘形を呈していた細胞が、ARCの発現を抑制することで、元の形態に戻ることを確認した。また、ARCの機能抑制による形質変化の一つとして、オキサリプラチンへの感受性が、ARCのノックダウンにより亢進することを明らかにした。さらに、大腸癌約１００例の臨床サンプルを用いて、ARCタンパクに対する特異的抗体を用いた免疫組織学的染色を行い、ARC遺伝子の組織における発現の部位を解析し、多くの症例で、ARCが癌の先進部（invasive front）に主に発現していることを確認した。ARCの発現と各症例の病理学的因子、さらには予後との関わりに関しては、現在解析中である。

Strategy for Future Research Activity

今後は、遺伝子ARCが生成するGag蛋白に内包されたARCのmRNAが細胞外において、どのように周囲の細胞に影響を与えるのかを明らかにする予定である。具体的には、レンチウイルスによってARC遺伝子を強制発現した大腸癌細胞株を用いて、72時間の培養後に培養液の回収を行い、その培養液によって別の細胞株（レシピエント）を一定期間培養し、レシピエントに与える影響を調べる予定である。また、腫瘍組織における遺伝子発現に関しては部位によって不均一性があり、腫瘍先進部、いわゆるinvasive front ではEMTを誘導するような癌微小環境が形成されると考えられるが、その詳細なメカニズムは不明な点が多い。今回着目する遺伝子ARCが、癌微小環境の中でどのように機能するかを詳細に調べるために、癌細胞を様々な細胞環境（低酸素、低栄養状態ならびにEGFRやTGFBなどのサイトカイン存在下）に暴露し、ARCの発現変化を調べることで、ARCの癌組織局所での機能を明らかにするとともに、周囲の細胞に与える影響を明らかにする予定である。さらに、消化器癌臨床検体とそれに対応する正常組織に対して免疫組織学的染色により調べ、臨床病理学的因子、予後、化学療法耐性との関連を明らかにする。標的遺伝子の発現と発癌・癌進展との関連が明らかとなれば、この遺伝子の治療標的としてのproof of conceptを取得することができるのみならず、これを癌の早期診断や、化学療法効果判定などのための有用なバイオマーカーとして活用することも可能である。