| Project/Area Number |
22K08837
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55020:Digestive surgery-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
平野 聡 北海道大学, 医学研究院, 教授 (50322813)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
YANG JAY 北海道大学, 医学研究院, 客員教授 (60897619)
七戸 俊明 北海道大学, 医学研究院, 准教授 (70374353)
中村 透 北海道大学, 医学研究院, 助教 (70645796)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 膵癌 / ICI / DNAアプタマー |
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| Outline of Research at the Start |
一般的に膵癌は腫瘍免疫活性が低く、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)の効果が乏しい現状であるが、下記３点を軸に転移膵癌に対する効果的な治療法を開発する。①共有結合DNAアプタマーを応用したICI(Immune checkpoint inhibit covalently-binding aptamers:ICIA)を開発し効果を検証する。②腫瘍選択的増殖型レトロウイルスベクターによる腫瘍免疫誘導を併用し、ICIAとの相乗効果を検証する。③IL-15アゴニストによるナチュラルキラー細胞（NK細胞）ならびに細胞傷害性T細胞（CTL）の誘導を加え、①②との複合療法を開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
膵癌は腫瘍免疫活性が低く、免疫チェックポイント阻害剤(ICI)の効果が乏しい現状であるが、共有結合DNAアプタマーを応用したICI(Immune checkpoint inhibit covalently-binding aptamers:ICIA)を開発し効果を検証する目的で研究を開始した。DNAアプタマーは生体内でDNAseの影響で速やかに分解されるため、効果が不安定という欠点がある。そこで共有結合を付加し安定したDNAアプタマーの作成の予備実験を施行した。Tabuchiらの論文（Chem. Commun.,2021,57,2483-86）を参考にthrombinに対するaptamer(thrombin binding aptamer:TBA) を共有結合化したアプタマーをコントロールとし、PD-L1に対する共有結合アプタマーを複数作成した。PD-L1に対するアプタマーの塩基配列は複数報告があるが、塩基数が比較的少なく複数検証された、aptPD-L1(Molecular Therapy-Nucleic Acids20165,e397)を選択し、16番目、20番目、45番目のT残基にwarheadを導入した共有結合型アプタマーを作成した。SDS-PAGEで観察すると、コントロールのTBAはthrombinとの結合が確認されたが、PD-L1とcovalent aptamer(T16,T20,T45,3riplet)の４種類はいずれも結合を確認できなかった。Native-PAGやSELEX bufferを用いたり、bufferの種類や条件設定を複数施行したが、いずれも結合を確認できなかった。そこで、癌細胞の増殖因子VEGF165に対する共有結合アプタマーを作成し実験系がワークしているかを検証した。結果、VEGF165共有結合アプタマー（T4,T17,T22）は３種ともVEGFとの結合が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
PD-L1に対する共有結合アプタマーは、DNAアプタマーの配列のうち、T残基にAr-SO2Fを結合して作成するが、複数のT残基からどの部位を選択するかの指標はない。今回は、PD-L1との結合部位そのものに被らず、かつ遠すぎない位置を選択しT16,T20,T45とその３種全部の４種類を作成した。しかし、抗原抗体反応と同様にDNAの三次元構造によっては、Ar-SO2F結合部位が、抗原との結合そのものを阻害する位置となっていた可能性がある。また、PD-L1とDNAアプタマーの結合は、SELEX法を用いた結合環境で決定した配列であるため、本実験で用いた共有結合型アプタマーの結合条件での反応が良くなかった可能性もある。そこで条件設定を可能な限りのバリエーションで施行を重ねたが解決には至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
PD三次元構造解析を用いれば、ある程度の予測が可能となるが、スーパーコンピュータを用いた解析を要するため、現時点のリソースでは厳しい可能性がある。現在、DNA構造解析のシミュレーションが可能な他教室との連携を模索している。
また、共有結合を組み込んだSELEX法によるPD-L1とDNAアプタマーの結合配列の探索の準備を行なっている。この場合、多数の候補を同定し新規配列の同定となるため、本研究期間の延長が必要となる。
また、共有結合のメリットを追求せず、既報のアプタマーを用いて、本来の目的である、①腫瘍選択的増殖型レトロウイルスベクターによる腫瘍免疫誘導を併用し、アプタマーとの相乗効果を検証する。②IL-15アゴニストによるナチュラルキラー細胞（NK細胞）ならびに細胞傷害性T細胞（CTL）の誘導を加え、複合療法の実験を進める予定である。
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