Lipid metabolism regulator RNF213 and immune evasion mechanisms in medulloblastoma

• Project/Area Number: 22K09281
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56010:Neurosurgery-related
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 峰晴 陽平 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (50716602)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: medulloblastoma / RNF213 / 髄芽腫 / miR-33a / 脂質代謝 / 免疫チェックポイント分子 / lipid metabolism / antitumor immunity / immune evasion

Outline of Research at the Start

髄芽腫は免疫細胞浸潤が抑制され、それが予後不良と関連するが、その分子機序は不明である。Rnf213は抗腫瘍免疫に影響する脂肪酸代謝制御因子であり、かつ髄芽腫を含めて多くの癌で変異が認められる。Rnf213 をノックアウトした髄芽腫モデルを作成したところ、抗腫瘍免疫回避能力が亢進することが確認された。本研究の目的は、同モデルを用いて、髄芽腫においてRnf213がどのような分子機序で、どの免疫細胞に作用して抗腫瘍免疫回避を誘導するかを解明し、治療の標的を同定することである。

Outline of Annual Research Achievements

Ptch1+/-; Rnf213-/-由来の髄芽腫とPtch1+/-; miR-33a由来の髄芽腫はともにSHH型髄芽腫において、脂質代謝因子をノックアウトしたモデルであり、Ptch1+/-単独のノックアウトマウス由来の髄芽腫と比べて、腫瘍の発生頻度、生着率、発育速度が上昇する。腫瘍の無発症生存率はPtch1+/-; Rnf213-/-よりもPtch1+/-; miR-33a-/-で低く、採取した腫瘍のヌードマウスへの生着率や発育速度はほぼ同じである。一方で、Rnf213欠損腫瘍細胞株は、miR-33a欠損腫瘍細胞株よりも、野生型マウスでの増殖力は有意に高かった。両者の遺伝子発現を比較すると、Rnf213欠損細胞株において、CD274(PD-L1)、CD38、CD88（C5ra-R1）が有意に高かった。これらはいずれも免疫チェックポイント分子であり、ヌードマウスでは同じスピードの発育が、野生型で異なるメカニズムの一つと考えられた。
ヒト髄芽腫細胞DAOYにおいて、RNF213をノックアウトすると、in vitroでの発育が遅延するが、in vivoではむしろ発育が促進された。In vitroでもserum starvationの状態にすると、RNF213ノックアウトの方が耐性を示し、環境に依存することが示された。GAS6の上昇が確認されたことから、GAS6をノックダウンするとstarvation耐性が失われた。GAS6はPD-L1発現を上昇させることから、虚血環境が抗腫瘍免疫にも影響すると考えられる。Rnf213欠損株においてGAS6をノックダウンして皮下に移植すると、発育が低下することから、免疫チェックポイント分子、虚血耐性因子の発現や免疫チェックポイント阻害薬の効果について実験を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

マウスの腫瘍細胞がin vitroで発育せず、試験管内の実験を進めることが困難であり、一部進行が遅れているが、一方で、代替する実験は予定以上に進めることができた。ヒト髄芽腫細胞DAOYを使って、RNF213をノックアウトした細胞を作成し、in vitroとin vivoの実験を行うことで、進捗の遅れを補っている。

Strategy for Future Research Activity

GAS6をノックダウンした細胞株を樹立したので、皮下移植モデルを使って実験を進める。PD-1阻害薬等によって、腫瘍の発育が遅延するかどうかの実験を進める。その際に、Ptch1+/-; Rnf213-/-とPtch1+/-; miR-33a-/-由来腫瘍における腫瘍内の免疫細胞浸潤の違い、PD-1阻害薬の影響の違いを明らかにするため、免疫組織染色で腫瘍および腫瘍周囲や腫瘍内に浸潤する細胞の特徴を明らかにする。虚血と免疫細胞浸潤の関係についても分析を進める。虚血状態の部分とそうでない部分において、MHCIや免疫チェックポイント分子の発現の差を分析する。GAS6の発現の有無がどのように影響するかを分析する。GAS6とPD-L1の関連性について確認し、GAS6がどのようにPD-L1の発現に影響するかを、AKTのリン酸化などのWestern blottingを通じて検証する。

Research Products

• [Presentation] RNF213 regulates tumorigenicity and induces starvation resistance via GAS6 in medulloblastoma. (2023)
  • Author(s): Yohei Mineharu, Takahiko Kamata, Yasuzumi Matsui, Toru Tezuka, Yuki Oichi, Takaaki Morimoto, Masahiro Tanji, Hatasu Kobayashi, Hiroko Okuda, Kouji H Harada, Akio Koizumi, Susumu Miyamoto, and Yoshiki Arakawa. 2023.09.16
  • Organizer: 日本がん学会