| Project/Area Number |
22K09481
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56030:Urology-related
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
中根 明宏 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70464568)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 大貴 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (00620931)
西尾 英紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (10621063)
林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134)
安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153)
丸山 哲史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (50305546)
水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 再生医療 / 腎 / ES細胞 / FACS / ネフロン / 尿路 |
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| Outline of Research at the Start |
Pax2遺伝子を導入したES細胞を分化させることで近位尿細管マーカーのAQP1陽性細胞となることが確認できた。本研究では、このPax2遺伝子導入ES細胞を分化させ、SclやVEGFなどの血管形成因子発現した多段階においてAQP1やCD31などのマーカーでFACSを行うことで未分化な細胞を除去し、糸球体や尿細管、血管への分化が進む状態にする。またWnt6やdHANDの存在下で尿路上皮や平滑筋細胞への分化を確認し、VimentinやACTA2などのマーカーでFACSを行う。これらの細胞で3次元培養を行い、腎尿路の類似構造をとるかを確認できたら、さらにマウス成体、特に腎臓に移植することで立体構造を持った腎組織へ分化し、生着できることを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝子導入ES細胞であるPax2 ES細胞を、Glasgow MEMにFCS、2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、sodium pyruvate、LIFを加えたもので培養し、次にPax2 ES細胞をhanging drop法を用いembryoid body (EB)を形成させた。5日後にEBを再度ディッシュ上で数日間分化を進めて細胞塊を回収した。さらに5、10日目でEBを回収した。EBの遺伝子発現の確認をするため、ディッシュに平面培養したES細胞およびEBを0.25%トリプシンEDTA溶液にて回収し、mRNAを抽出、2-プロパノール、エタノールにて沈殿させ回収した。回収したEBに目的の遺伝子が発現しているかどうかをRT-PCR法を行った。回収したEBはRT-PCR法でPax2遺伝子が発現していることが確認できた。また他の腎発生の各段階で発現 して くる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認したところ、aquaporin-1、Integrin a8、BMP4、BMP7、Pax8、Podocinの発現上昇が認められた。そこ で、これらのEBをPax2発現細胞に対し、Pax2で標識した細胞を回収する条件でFACSを行い、細胞回収を行った。これらの細胞に対し、再度上記の遺伝子の発現が 上昇しているかをRT-PCR法で確認したところ、aquaporin-1の上昇が確認できた。今後他の培養条件を試し、違う性質の細胞が回収できるかを繰り返しながら、こ標的の細胞への分化が起こっているかの確認を継続する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初期段階の細胞分化の確認はできたものの、他の培養条件での遺伝子発現が確認できていないため。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、追加された知見を取り入れながら、培養条件決定を継続する。
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