シングルセル解析を用いたオートファジー依存型結石抑制遺伝子の同定
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22K09508
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56030:Urology-related
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
海野 怜 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (40755683)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田口 和己 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (00595184)
安藤 亮介 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (30381867)
安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153)
岡田 淳志 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70444966)
杉野 輝明 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (70881746)
濱本 周造 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (80551267)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | オートファジー / 尿路結石 / RNA sequencing / シングルセル / 腎結石 / シングルセルRNAシークエンス |
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| Outline of Research at the Start |
尿路結石の生涯罹患率は増加しており、形成機序の解明と再発予防法の確立は急務である。私たちは、細胞保護作用をもつオートファジーの低下が、結石形成の契機になることを発見し、オートファジーの制御により結石形成を予防できるという概念を提唱した。本研究では、上述した研究[1] [2]で腎尿細管培養細胞、ヒト腎乳頭組織を用いたトランスクリプトーム解析を行い、結石抑制に特異的なオートファジー依存型結石抑制遺伝子を同定する。さらに、上述研究[3]で同定遺伝子の結石抑制効果をマウスモデルで検証することで、分子標的治療へと臨床応用することを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
オートファジー活性を調べるために、tandem fluorescent-tagged LC3 (tfLC3) を48時間transfectionしたHK2細胞(5x104個/well)に対して、CaOx1水和物(COM)結晶を1, 10, 20, 40μg/cm2の濃度で、2, 6, 12, 24, 48時間暴露させた。細胞を回収後、細胞を単離・溶解し、mRNAをバーコードを付加したビーズとハイブリダイズさせる。逆転写反応を行い、バーコード配列を有したcDNAを作成、増幅させ、library準備を行い、sequencingを行った。
オートファジーの活性を、共焦点顕微鏡によるGFP-RFP-MAP1LC3シグナルの観察で評価したところ結晶負荷により有意にオートーファジーが低下した。さらにシークエンス結果を、発現差異解析 (Differential expression gene analysis: DEGA): scanpy softwareのrank_genes_group moduleを使い群間の遺伝子発現の差を計算したところ、結晶負荷した群においてはMIFやIL6、さらには炎症性マクロファージに代表される炎症の遺伝子が有意に上昇していた。つぎに、擬時系列解析 (Pseudotime analysis)によって、主成分分析(PCA)による次元削減後の発現プロファイルの類似度に基づいて推定された軸に沿って細胞を配置し、細胞間で起点となる群から終点となる群を同定したところ、これら炎症系の遺伝子をマーカーとする細胞集団群が起点となる可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
In vitroの研究は計画通り進んでいる。ヒト検体の結果は、現在解析中であり、そちらも順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
解析を進めていく
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Report
(2 results)
Research Products
(3 results)
