シングルセル解析を用いたオートファジー依存型結石抑制遺伝子の同定

Research Project

Project/Area Number	22K09508
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 56030:Urology-related
Research Institution	Nagoya City University
Principal Investigator	海野怜名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (40755683)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	田口和己名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (00595184) 安藤亮介名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (30381867) 安井孝周名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153) 岡田淳志名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70444966) 杉野輝明名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (70881746) 濱本周造名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (80551267)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Keywords	尿路結石 / シングルセル / RNA sequencing / 腎結石 / オートファジー / シングルセルRNAシークエンス
Outline of Research at the Start	尿路結石の生涯罹患率は増加しており、形成機序の解明と再発予防法の確立は急務である。私たちは、細胞保護作用をもつオートファジーの低下が、結石形成の契機になることを発見し、オートファジーの制御により結石形成を予防できるという概念を提唱した。本研究では、上述した研究[1] [2]で腎尿細管培養細胞、ヒト腎乳頭組織を用いたトランスクリプトーム解析を行い、結石抑制に特異的なオートファジー依存型結石抑制遺伝子を同定する。さらに、上述研究[3]で同定遺伝子の結石抑制効果をマウスモデルで検証することで、分子標的治療へと臨床応用することを目指す。
Outline of Annual Research Achievements	まずは、seq-well方法を用いたsingle cell RNA seqencing前までの組織の処理、準備を確立した。手順としては、採取した新鮮組織を消化酵素処理し、全細胞を単離後、バーコードを付加したビーズ処理を行った後、バーコード配列を有したcDNAを作成しました。cDNAを増幅させ、libraryを作成した。それを次世代シークエンサーを用いてsequencingを行い、得られた結果を共同研究先であるUCSFのHuangラボと分析を行いました。用いる組織は、結石患者では尿管結石のため内視鏡手術ではなく腎全体を摘出することになった組織のうち、腎乳頭を含む皮質から乳頭部までを用いました。非結石患者は、局所腎癌のため腎摘出術を行なった患者の、正常部分の腎乳頭を含む皮質から乳頭部までを用いました。結石患者と非結石患者それぞれ10検体ずつ腎組織を用いて、sequenceと分析を行いました。クラスタリング(heatmap)を行ったところ15のサブクラスター(細胞集団)が同定されました(UMAP: Uniform Manifold Approximation and Projectio,dimension reduction technique for visualization.)。特に、従来言われていた腎臓を構成する細胞群だけではなく、特に免疫細胞のあらたなサブクラスターを見出しました。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 組織の処理、sequencingなど順調に進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	今後は、サブクラスタリング解析を進め、尿路結石形成に関わるシグナルや遺伝子などを同定する予定です。