| Project/Area Number |
22K09760
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56060:Ophthalmology-related
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
菅野 江里子 岩手大学, 理工学部, 准教授 (70375210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
富田 浩史 岩手大学, 理工学部, 教授 (40302088)
田端 希多子 岩手大学, 理工学部, 特任准教授 (80714576)
小松 三佐子 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 客員研究員 (00525545)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | アデノ随伴ウイルス / 視細胞 / 網膜色素変性症 / 遺伝子導入 / オプトジェネティクス / 網膜 |
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| Outline of Research at the Start |
我々が新規に開発した光感受性クロライドイオンチャネルChimGt12 （特許出願PCT/JP2021/012283）を変性前の視細胞に発現させることで、変性を遅延させることに成功した。しかしながら、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV) の網膜下投与により遺伝子導入を行ったために、その効果は遺伝子発現部位に限局していた。より広範囲に遺伝子導入を行うことで、保護効果を高められる可能性がある。
本研究では、バイオインフォマティクスによりAAVのcapsidタンパク質を新たにデザインすると共に、細胞への透過性を改善する薬剤の検討により、硝子体内投与でも、効率よく視細胞へ遺伝子導入を行う方法を開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は新規光感受性陰イオンチャネルChimGt12および遺伝子Xを開発している。これまでの実験において、視細胞変性前の視細胞へChimGt12を発現させることで、局所において変性を遅延させることに成功した。しかしながら、視細胞をターゲットとした遺伝子導入のためアデノ随伴ウイルス(AAV)の網膜下投与を行った結果、遺伝子導入部位が投与部に限局されており、より広範囲な遺伝子導入により光応答を増強できると考えた。
本研究では、網膜周辺部を含めた広範囲に遺伝子導入を行うため、視細胞への親和性の高いAAVの開発を目的としている。AAV表面抗原と感染細胞のAAV受容体の結合のモデリング解析を行い、AAVの細胞への結合を変化させる候補capsidのデザインを行い、AAVを作製して様々な細胞株を用いて感染効率の比較検討を行った。その中で視細胞のモデル株をされてきたY79細胞への感染効率が高いconstructを得た。Y79のみに高い感染効率を示したconstruct、多くの細胞で遺伝子導入効率が改善されたconstructが得られた。
本年度は、これらベクターを正常ラットの網膜下投与し、遺伝子導入範囲の確認をMicronⅢにより行ってきた。現在比較検討を継続中である。
豚眼を用いた組織培養による遺伝子導入効果の検討では、豚眼から網膜を得て、培養可能な条件および網膜崩壊日数について検討を行ってきたが、豚眼を得た際に、サンプル間で細胞の状態が異なることが分かり、取得日によっては観察が困難であった。組織培養を用いた遺伝子導入効果の検討は、動物愛護の観点からも重要であり、且つ、研究を効率的に進めるために必須である。そのため、今後は動物種と手法の変更を行う事とした。以上の結果より、本年度の網膜における遺伝子導入確認は、正常ラットを用いて行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
硝子体投与時に内境界膜においてトラップされず、また、網膜内部までAAVを到達させるために、AAV結合サイトのモデリングを行ってきた。具体的には、AAV表面抗原と感染細胞におけるAAV受容体の結合のモデリング解析を行い、ベクターの最適化を行った。これら手法により、AAVの細胞への結合を変化させる候補capsidをデザインし、デザインに基づきAAV constructを作製し、様々な細胞種への感染により、遺伝子導入効率の変化を確認してきた。
本年度は、更にデザインによりを追加してconstructを増やし、培養細胞を用いた遺伝子導入効率の評価を行い、候補constructの数を増やすと共に、これまで開発したベクターと比較し、絞り込み等を行った。
これらの中から数種のAAV constructについて、正常ラットへの網膜下投与を行い、遺伝子導入範囲の確認をMicronⅢおよび網膜伸展標本により行っており、現在継続中である。
豚眼を用いた組織培養による遺伝子導入効果の検討では、豚眼から網膜を得て、培養可能な条件および網膜崩壊日数について検討を行ってきた。その結果、組織を得た際に、サンプル間で細胞の状態が異なることが分かったが、食肉加工場から豚眼を得る際の条件を一定化することは困難である。AAVを用いた細胞株への遺伝子導入では、安定的な発現確認には最低4日の培養が必要である。しかしながら、4日間健全に網膜組織を維持することが困難であった。当初、豚眼の組織培養数を増やすことで解析可能と考えたが、サンプル取得日によっては、解析が困難である現象が確認されたため、海外の研究者から指導を受け、動物種と手法の変更を行う事とした。そのため、本年は網膜における遺伝子導入確認は正常ラットを用いて行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
組織培養を用いた遺伝子導入効果の検討は、動物愛護の観点からも重要であり、且つ、研究を効率的に進めるために必須である。分散した細胞ではなく、組織として培養を行い、遺伝子導入細胞を網膜断層の免疫染色により明らかにできる系を完成させる。現在まで、組織培養の断層評価法は確立しており、大きな問題は用いる組織サンプルであると考える。動物への投与では遺伝子発現が確認されるには、約2か月を要するが、組織培養では約5日で可能である。
モデリングを行い、作製したAAVについて、遺伝子発現の効率および細胞種への特異性を In vitroおよびIn vivoにおいて解析し、改変遺伝子との関わりを調べる。現在、正常ラットを用いた遺伝子導入範囲の確認を行っており、引き続き、MicronⅢを用いた蛍光眼底撮影により、導入遺伝子Venusの発現範囲を調べる。また、遺伝子が導入された細胞層を明らかとするため、組織標本を用いたZ軸断面撮影および免疫染色を行う。更に、その後、
組織標本を作製し、網膜層の観察により、より詳細な遺伝子導入細胞の分布を調べる。
本研究では、視細胞特異的に広範囲に遺伝子発現させることを目的としている。現在、CAGプロモーターを用いてAAVを作製しており、遺伝子導入効率が高く、プロモーターで制御する方法がよいか、あるいは、細胞選択性が高いAAVを用い視細胞へ遺伝子導入する方法がよいか、が不明である。その為、最終的には、このどちらが有用であるか、検討する必要があると考える。
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