| Project/Area Number |
22K11825
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 59040:Nutrition science and health science-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
都築 巧 京都大学, 農学研究科, 助教 (50283651)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
真鍋 祐樹 京都大学, 農学研究科, 助教 (20730104)
山崎 正幸 龍谷大学, 農学部, 教授 (80397562)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2025: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | 長鎖脂肪酸 / CD36 / 特異的結合相互作用 / 蛍光増強試験 / 構造解析 / 結合試験 / 結合様式 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、我々が考案した無細胞 in vitro 試験を適用して、長鎖脂肪酸とクラスBスカベンジャー受容体の一種 CD36 の特異的結合相互作用の立証を試みる。また、長鎖脂肪酸－CD36複合体の X 線結晶構造解析にも取り組む。また、長鎖脂肪酸だけでなく、超長鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸やその他の脂肪酸関連物質についても CD36 との特異的結合相互作用とその結合様式について明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳動物では、リノール酸などの長鎖脂肪酸は CD36 (cluster of differentiation 36) を介して細胞内に取り込まれると考えられている。しかしながら、両者が特異的に相互作用するかは不明である。本研究では、蛍光増強試験等を適用して長鎖脂肪酸およびその関連物質とCD36 の特異的結合の立証を試みる。さらに、脂質－CD36複合体の X 線結晶構造解析にも取り組む。蛍光増強試験ではCD36のアミノ酸149から168の領域部分のペプチド (CD36(149-168) ペプチド) に蛍光色素を付加したものをプローブとする。蛍光色素は周辺の疎水度に応じて放出蛍光が増加するという性質があり、これを利用して特異的結合を検証する。実際、マウスCD36(149-168)ペプチドに対して脂肪族アルデヒドなどが特異的に結合することをすでに報告している。一方、長鎖脂肪酸の場合そのような結果は得られていなかった。
令和4年度、飽和型の脂肪酸のひとつであるラウリン酸 (C12:0) が上記プローブペプチドに特異的に結合するという結果を得た。令和5年度はラウリン酸とCD36の結合には当該脂肪酸のカルボキシ基、CD36(149-168)中の塩基性アミノ酸残基は必要でないことを明らかにした。令和4年度、ヒト型のCD36(149-168)ペプチドを合成し、これを用いた蛍光増強試験を行なったところ、オレイン酸などの長鎖脂肪酸のこのものへの特異的結合は観察されないことが示された。本年度、反応系に脂肪酸の分散化剤であるメチル-beta-デキストリンを添加したところ、それを支持する結果を得たが、結合のEC50値が高く、さらに結果に再現性があるかの確認が必要である。また、CD36(146-168)とグルタチオン-S-トランスフェラーゼの融合タンパク質発現のためのベクターを構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究においてラウリン酸 (C12:0) がCD36(149-168)に特異的に結合するということが明らかにされたが、それについては一定の意義があると考えている。他方、いわゆる総炭素数が14以上の長鎖脂肪酸については、それについて立証できていないため。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.昨年度に引き続き、メチル-beta-デキストリン等の存在下、オレイン酸などの長鎖脂肪酸とCD36(149-168)ペプチドの特異的結合を検討する
2.オレイン酸などの長鎖脂肪酸のアナログ、およびラウリン酸のアナログとCD36(149-168)ペプチドに対する特異的結合を蛍光増強試験により調べる。
3.昨年度、ラウリン酸やそのアナログがCD36(149-168)と結合する際、そのアミノ酸領域の塩基性アミノ酸は必須ではないことが明らかにした。そこで本年度は当該相互作用におけるCD36(149-168)中のセリン残基の重要性について検証する。
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