老化状態からの細胞増殖の回復を担う因子の探索

Research Project

Project/Area Number	22K11858
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 59040:Nutrition science and health science-related
Research Institution	Iwate Medical University
Principal Investigator	牛島弘雅岩手医科大学, 薬学部, 助教 (90509043)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000) Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Keywords	細胞老化 / 抗酸化活性 / necrostatin / necroptosis / ラジカル除去活性 / RNAシーケンシング / RNA-seq / 細胞増殖 / アンチエイジング
Outline of Research at the Start	本研究課題は、抗酸化作用を有する化合物を老化細胞に作用させた場合に見られる細胞増殖能の回復現象を分子生物学の手法を用いて解析し、その現象を担う制御因子の特定を目的とする。老化細胞による種々の悪影響を取り除く先行研究領域に、「老化細胞を正常細胞の状態に回復させる」という新しい研究ステージを提供しうるものである。また、増殖が極端に遅い・あるいは完全に増殖が停止した細胞が、再び増殖能を取り戻す現象の分子機構が判明すれば、増殖が遅い細胞を取り扱う研究分野（神経細胞、幹細胞、心筋細胞など）への波及効果も十分に期待できる。
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、抗酸化作用を有する医薬品を用いて、老化細胞が正常（若い）細胞のような増殖機能を回復する医薬品をスクリーニングし、増殖能回復現象を分子生物学的手法により分析し、その分子機構に与る因子を明らかにすることを目指す。本研究は、「老化から正常細胞への機能回復」という観点から、加齢性疾患を克服する治療法を提供しうる研究である。これまでの予備検討により、抗酸化作用を有するイデベノン等の薬物にそのような作用があることを見出している。本年度は、抗酸化作用を有する新たな候補化合物として見出したnecrostatin（nec）誘導体に関して、そのラジカル除去能力の構造活性相関などの化学的諸性質を解析した。また、ヒト老化細胞の細胞増殖に与える影響に関しても、並行して検討を行った。 necrostatin誘導体は、制御された細胞死の1つ形態であるnecroptosisを抑制する働きを有する化合物として知られており、その誘導体の1つであるNec-1sは、マウスの発毛促進作用があることも報告されている。これらnecrostatin誘導体の細胞死抑制作用は、その標的酵素であるRIPキナーゼの阻害作用によってRIPキナーゼの下流の細胞死シグナルが減衰すること考えられてきた。その作用に加え、Nec-1及びNec-1iの2つの化合物はスーパーオキシドアニオン（活性酸素種の1つであり、細胞内での酸化ストレスの一因）に対するラジカル除去能を有することが確認できた。この抗酸化作用によってラジカルを直接的に除去することが、細胞死の抑制に寄与していると考えられる。また、ヒト老化細胞の細胞増殖能に対しては、イデベノンと同程度の増殖促進作用を示すことが分かった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 昨年度より継続して行っていた化合物スクリーニングによってNecrostatinを始めとする新たな抗酸化作用を有する化合物をピックアップすることができたため、それら化合物の抗酸化能を評価する実験及び解析する時間が追加で必要となった。老化細胞を使った細胞生物学的な検討を並行して実験しているので、そちらに費やす解析時間が減っていることも要因のひとつである。
Strategy for Future Research Activity	異なる濃度の薬剤作を用させたIMR90及びIMR90-SCからtotal RNAを抽出し、RNAシーケンシング（RNA-seq）用のライブラリーをすでに調製済みである。コントロール群（薬剤未処理）の細胞から抽出したRNAについても同様に調製し、RNA-seqを実行する。それらの結果を比較し、シーケンシングデータを解析する。シーケンシングデータの解析は、トリミングやゲノムへのマッピング、リードカウントデータの作成等を行う。RNA発現変動量の比較解析（DEGs: differentially expressed genes 解析）は、既存の統合解析環境を使用する（TCC-GUI,iDEP）。正常細胞及び老化細胞のシーケンスデータを比較し、薬剤処理群の老化細胞に特異的に発現変動が見られるシーケンスデータを集積する。細胞増殖能に関して既報があるものは優先して調査し、DEGsの結果に由来するタンパク質間の相互作用の予測にはデータベース:STRING database(https://string-db.org/) を使用する。次年度は研究計画の最終年度であり、リストアップされた遺伝子の発現系及びノックダウン系の構築・解析を最優先の課題と設定したい。老化細胞: IMR90-SCの他、比較対象の細胞としてiPS細胞も使用予定である。細胞増殖回復シグナルが普遍性をもつか否かについては、老化した臓器・組織の対象を広げて検討したい。