| Project/Area Number |
22K12381
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 63020:Radiation influence-related
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
砂谷 優実 金沢医科大学, 医学部, 講師 (70581057)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | アポトーシス |
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| Outline of Research at the Start |
がん細胞がアポトーシスを起こすと、細胞表層のCD47がクラスターを形成し、それによりeat-me signal が露出し、マクロファージにより貪食除去されるようになる。申請者はこれまでに、DNA損傷修復蛋白質53BP1がCD47のクラスター形成を促進すること、およびアポトーシス時には53BP1がC末断片化し細胞表層に局在することを見出した。本研究では、アポトーシスがん細胞において、53BP1がどのようにしてCD47クラスター形成を促進するのか、その分子機構を明らかにする。CD47クラスター形成機構の解明は、その機構を標的とした、がんに対する新規治療薬の開発へつながることが期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Don’t eat-me signal分子であるCD47は、細胞の表層に露出して食細胞表層の貪食阻害受容体SIRPalphaと結合することで貪食を防いでいる。一方、アポトーシス細胞の表層においては、CD47は脂質ラフト層でクラスターを形成してSIRPalphaと解離し、貪食によるアポトーシス細胞の排除を促すと考えられている。研究代表者はこれまでに、DNA修復タンパク質53BP1がカスパーゼの基質となりC末断片化すること、および53BP1を欠損したアポトーシス細胞ではCD47のクラスター形成が減少していることを見出した。本研究では、53BP1が、カスパーゼによるC末断片化を引き金としてCD47のクラスター形成を誘導することで、食細胞によるアポトーシス細胞の貪食除去を促すというモデルを立案した。このモデルを立証するため、CD47のクラスター形成およびアポトーシス細胞の貪食における53BP1C末断片化依存性の有無を検証し、53BP1C末断片に存在すると考えられる機能ドメインを明らかにしようと試みた。
R5年度は、候補となる機能ドメインの変異型53BP1C末断片安定発現細胞株全種類を樹立した。それらの細胞株を用いた解析により、CD47のクラスター形成が53BP1C末断片中のBRCTドメイン依存性の現象であることを明らかにした。さらにCD47のクラスター形成は、BRCTドメインに存在するリン酸化タンパク質結合責任アミノ酸残基を必要とすることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1）R5年度に樹立が困難であったBRCTドメイン変異型53BP1C末断片安定発現細胞株の樹立に、別の手法を用いて再度取り組んだ。CRISPR/Cas9のゲノム編集によるノックイン技術を用いて、53BP1遺伝子座に存在するBRCTドメインの機能性アミノ酸残基（既に報告のある3つのアミノ酸残基）それぞれに対して塩基置換変異を導入することで、53BP1BRCTドメイン変異細胞株を樹立することを試みた。その結果、高頻度でゲノム編集が起こり、目的のBRCTドメイン変異細胞株3種類を複数クローン樹立することができた。
2）1）で樹立した細胞株、およびR4年度までに樹立していた野生型、5BP1欠損型、および53BP1C末断片安定発現細胞株各種を用いてアポトーシス細胞表層におけるCD47のクラスター形成に必要な機能ドメインを検索した。その結果、53BP1欠損により引き起こされるCD47のクラスター形成の減少は、53BP1C末断片安定発現株では回復したが、BRCTドメイン変異株のうちリン酸化タンパク質結合変異細胞株では回復しなかった。この結果から、アポトーシス細胞表層におけるCD47のクラスター形成は、53BP1C末断片に存在するBRCTドメインが持つリン酸化タンパク質結合活性依存性であることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度であるR6年度では、野生型、53BP1欠損型、53BP1C末断片発現細胞株およびヒトマクロファージ株を用いて、以下の3つの現象がアポトーシス細胞の53BP1C末断片に存在するBRCTドメイン内のリン酸化タンパク質結合活性依存性であるかを検証する。
1）CD47とSIRPalpha結合の解離
2）eat-me signal分子の細胞表層CD47領域外への露出
3）アポトーシス細胞貪食の誘導
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