新規無針注入器によるDNA・蛋白質の皮内投与によるワクチン効果と遺伝子治療増強

• Project/Area Number: 22K12772
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 90110:Biomedical engineering-related
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 善本 隆之 東京医科大学, 医学部, 教授 (80202406)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 溝口 出 東京医科大学, 医学部, 講師 (00569527)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 無針注射器 / 抗腫瘍ワクチン / アジュバントフリー / ワクチン / アジュバント

Outline of Research at the Start

最近、予備的実験より、火薬の燃焼エネルギーで駆動する新規の無針注入器（PJI）が、皮内へのDNA投与により、有針注射器より強力な抗腫瘍免疫を誘導することや、アジュバントを加えずに蛋白質投与のみでも、抗原特異的細胞性免疫を増強することも見出した。そこで、本研究では、モデル抗原および分子として卵白アルブミン（OVA）と免疫抑制性サイトカインIL-27を用い、OVAプラスミドDNA投与による抗腫瘍ワクチン効果、アジュバントフリーのOVA蛋白質投与による抗腫瘍ワクチン効果、さらには、IL-27プラスミドDNA投与による遺伝子治療への応用について、新規無針注入器の有効性とその作用機序を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

2023年度は、新規無針注射器PJIを用いてアジュバンドは加えずに蛋白質投与による抗腫瘍ワクチン効果の増強とその作用機序について検討を行った。
①抗腫瘍ワクチン効果：エンドトキシンフリーのOVA蛋白質をPJIおよび通常の有針注射器を用いて皮内投与を行い、2週間間を空けて2度免疫1週間後に、所属リンパ節細胞を蛍光標識したMHCクラスI/IIのOVA peptideテトラマーと抗CD4/抗CD8抗体で染色しFACS解析を行った。その結果、有針注射器では殆ど誘導されないが、PJIによる投与では、ポジコンで用いたAlumと同レベルに強いOVA抗原特異的CD8+T細胞を誘導した。OVA抗原特異的CD4+T細胞の誘導は、有針でもPJIでも殆ど誘導されなかった。しかし、血中のOVA特異的抗体価もIgG1とIgG2aともに、PJIで増強され有針注射器では増強されなかった。さらに、そこへ、EG.7-OVA腫瘍を植えても、PJIを用いて投与するとAlumと同レベルに強い腫瘍増殖の抑制効果、つまり、ワクチン効果を示すことがわかった。
②作用機序の解明：作用機序を調べるために、Alex647標識OVA蛋白質をマウスにPJIまたは無針注射器を用いて投与し、12時間後皮膚から細胞を調製し、24時間後にはリンパ節細胞を種々の抗体で染色し、Alex647標識OVA蛋白質がどの細胞に多く入っているかを調べた。その結果、PJIを用いて投与すると有針注射器に比べ、皮膚細胞およびリンパ節細胞で共にクロスプレゼンテーション能力が高い樹状細胞（DC）であるXCR1+MHC ClassII+CD11c+DCやCD205+MHC ClassII+CD11c+DCに、さらに、リンパ節細胞では、CD86+MHC ClassII+CD11c+DCに多く取り込まれていた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

予定通り、新規無針注射器PJIを用いてアジュバンドは加えずにDNA投与のみならず、蛋白質投与でも、強いCD8+T細胞を介したワクチン効果を誘導することが明らかになってきているので。

Strategy for Future Research Activity

2024年度は、新規無針注射器PJIを用いてアジュバンドは加えずに蛋白質投与による抗腫瘍ワクチン効果を増強する作用機序の検討と、さらに、mRNAワクチンの増強作用についても検討する。
①蛋白質投与による抗腫瘍ワクチン効果増強の作用機序：昨年度までの検討より、クロスプレゼンテーション能力の高いDCに取り込まれ、DCの成熟マーカーCD86発現も増強されていたので、DAMPsの関与が考えられる。さらに、最近、PJIの火薬爆発による強力な推進力によりシェアストレスが発生し、さらに、シェアストレスがHigh mobility group box 1（HMGB1）発現を誘導しDCの成熟化を誘導する可能性も示唆された。そこで、PJIでOVA蛋白質投与後、皮膚より蛋白質溶解液を調製し、ウエスタンブロット解析により、HMGB1発現の増強や細胞質と核に分離し細胞内の局在を調べる。次に、HMGB1の阻害剤であるグリチルリチンをPJI投与前に投与し、OVA抗原特異的CD8+T細胞の誘導能や抗腫瘍効果へのHMGB1の関与を検討する。
②mRNAワクチンの増強作用：COVID-19 mRNAワクチンの副作用の原因として、Pseudouridineを用いて炎症を軽減したmRNAのワクチン効果を増強するために用いたLipid nanoparticle（LNP）の炎症誘導作用が考えられている。そこで、OVAをモデル抗原として通常のUridineおよびPseudouridineを用いて作製したOVA mRNAを用いて、LNPの代わりにPJIで投与し、OVA特異的CD8+T細胞誘導の割合や、皮膚局所よりRNAを抽出しリアルタイムRT-qPCRおよび血清でのELISAより炎症マーカーであるTNF-aやIL-6の発現を比較検討し、PJIを用いて副作用である炎症誘導能が低いがワクチン効果が高い結果が得られないか検討する。

Research Products

• [Journal Article] A Promising Needle-Free Pyro-Drive Jet Injector for Augmentation of Immunity by Intradermal Injection as a Physical Adjuvant (2023)
  • Author(s): Jukito Sonoda,Izuru Mizoguchi,Shinya Inoue,Aruma Watanabe,Ami Sekine,Miu Yamagishi,Satomi Miyakawa,Natsuki Yamaguchi,Eri Horio,Yasuhiro Katahira,Hideaki Hasegawa,Takashi Hasegawa,Kunihiko Yamashita and Takayuki Yoshimoto
  • Journal Title: Int J Mol Sci. Volume: 24 Issue: 10 Pages: 9094-9094
  • DOI: 10.3390/ijms24109094
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Potent antitumor effects of the conditioned medium of bone marrow-derived mesenchymal stem cells via IGFBP-4. (2023)
  • Author(s): Furusaka Y, Inoue S, Mizoguchi I, Hasegawa H, Katahira Y, Watanabe A, Sakamoto E, Sekine A, Miyakawa S, Umezu T, Owaki T, Yoneto T, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: in press Issue: 6 Pages: 2499-2514
  • DOI: 10.1111/cas.15789
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Protective effects of conditioned media of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous teeth on pressure ulcer formation. (2023)
  • Author(s): Katahira Y, Murakami F, Inoue S, Miyakawa S, Sakamoto E, Furusaka Y, Watanabe A, Sekine A, Kuroda M, Hasegawa H, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Journal Title: Front Immunol. Volume: 13 Pages: 1010700-1010700
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Induction of potent antitumor immunity by intradermal <scp>DNA</scp> injection using a novel needle‐free pyro‐drive jet injector (2022)
  • Author(s): Inoue Shinya、Mizoguchi Izuru、Sonoda Jukito、Sakamoto Eri、Katahira Yasuhiro、Hasegawa Hideaki、Watanabe Aruma、Furusaka Yuma、Xu Mingli、Yoneto Toshihiko、Sakaguchi Naoki、Terai Kazuhiro、Yamashita Kunihiko、Yoshimoto Takayuki
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 114 Issue: 1 Pages: 34-47
  • DOI: 10.1111/cas.15542
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A patient with stage IIIB advanced breast cancer who is still alive 24 years after surgery; a case report and remarks to the treatment strategies. (2022)
  • Author(s): Yoneto T, Hasumi K, Fujii Y, Takahashi N, Seki N, Yoshimoto T, Takeda Y.
  • Journal Title: Transl Cancer Res. Volume: 11(10) Issue: 10 Pages: 3903-3911
  • DOI: 10.21037/tcr-22-1363
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Rap1 prevents colitogenic Th17 cell expansion and facilitates Treg cell differentiation and distal TCR signaling (2022)
  • Author(s): Ishihara Sayaka、Sato Tsuyoshi、Fujikado Noriyuki、Miyazaki Haruka、Yoshimoto Takayuki、Yamamoto Hiromitsu、Fukuda Shinji、Katagiri Koko
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 5 Issue: 1 Pages: 206-223
  • DOI: 10.1038/s42003-022-03129-x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Changes in Expression of Specific mRNA Transcripts after Single- or Re-Irradiation in Mouse Testes (2022)
  • Author(s): Nagahori Kenta、Qu Ning、Kuramasu Miyuki、Ogawa Yuki、Kiyoshima Daisuke、Suyama Kaori、Hayashi Shogo、Sakabe Kou、Yoshimoto Takayuki、Itoh Masahiro
  • Journal Title: Genes Volume: 13 Issue: 1 Pages: 151-151
  • DOI: 10.3390/genes13010151
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 新規無針注射器を用いたDNAの皮内投与による抗腫瘍細胞性免疫の増強 (2023)
  • Author(s): 善本隆之
  • Organizer: 東京医科大学・医総研Annual Meeting 2022
• [Presentation] Induction of CD8+ T cell-mediated antitumor immunity by intradermal protein injection with a new pyro-derive jet injector. (2023)
  • Author(s): Sonoda J, Mizoguchi I, Katahira Y, Hasegawa H, Yamashita K, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第82回日本癌学会学術総会
• [Presentation] イミキモド誘導性乾癬モデルにおけるストレス応答性MAPキナーゼASK1の役割とその作用機序 (2023)
  • Author(s): 長谷川英哲、渡邉有麻、溝口 出、片平泰弘、関根碧水、山岸美宇、園田寿希心、宮川聡美、前田龍郎、原田和俊、大久保ゆかり、善本隆之
  • Organizer: 第38回日本乾癬学会総会・学術大会
• [Presentation] Protective effect of conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous tooth on the peripheral neuropathy of experimental autoimmune neuritis. (2022)
  • Author(s): Hasegawa H, Sakamoto E, Katahira Y, Miyakawa S, Murakami F, Inoue S, Watanabe A, Furusaka Y, SekineA, Owaki T, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: JSICR/MMCB 2022 Joint Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Inhibitory effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on tumor growth and its possible molecular mechanism. (2022)
  • Author(s): Furusaka Y, Katahira Y, Hasegawa H, Umezu T, Mizoguchi I, Yoneto T, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第81回日本癌学会学術総会
• [Presentation] 骨髄由来間葉系幹細胞の腫瘍増殖の抑制効果とその作用機序 (2022)
  • Author(s): 米戸敏彦、古阪悠馬、片平泰弘、宮川聡美、長谷川英哲、溝口出、善本隆之
  • Organizer: 第30回乳癌基礎研究会
• [Presentation] Conditioned medium of immortalized stem cells from human exfoliated deciduous tooth exhibit protective effect on the peripheral neuropathy of experimental autoimmune neuritis. (2022)
  • Author(s): Sakamoto E, Hasegawa H, Katahira Y, Miyakawa S, Watanabe A, Mizoguchi I, Yoshimoto T.
  • Organizer: 第51回日本免疫学会総会・学術集会
• [Presentation] アデノウイルス由来の小分子核酸「VA-RNA」を内包した細胞外小胞のIFN誘導機能と抗腫瘍効果 (2022)
  • Author(s): 小山 義之、伊藤 智子、杉浦 喜久弥、善本 隆之、溝口 出
  • Organizer: 第9回日本細胞外小胞学会学術集会