| Project/Area Number |
22K14862
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 38060:Applied molecular and cellular biology-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
白石 晃將 京都大学, 農学研究科, 助教 (70908110)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | メタノール酵母 / mRNA / タンパク質 / オートファジー / 転写後調節 |
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| Outline of Research at the Start |
植物葉面におけるメタノール酵母（C1酵母）の生存戦略に関する研究などから、mRNAとタンパク質分解が担う遺伝子発現調節の重要性が示唆されているが、C1酵母の転写後における両分子の制御機構については未解明である。そこで本研究の目的を『C1酵母におけるmRNAとタンパク質可視化系の構築とそれら分子の分解制御におけるオートファジーの役割の解明』に設定する。局在性や分解量の観点から、mRNAとタンパク質の液胞内分解における生理的意義の違いやメタノール誘導性遺伝子の発現調節におけるオートファジー分解の役割を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、メタノール酵母におけるmRNAとタンパク質可視化系の構築とそれら分子の分解制御におけるオートファジーの役割の解明を目的とした。特に、アルコールオキシダーゼ（AOD）、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DAS）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（FLD）などメタノール誘導性mRNA（methanol-inducible mRNA: mimRNA）とタンパク質に着目している。
昨年度は、mimRNAの細胞内動態を追跡する可視化系の構築に成功し、同mRNAが細胞質にてmimRNA granules（mimRNAg）と名付けた顆粒構造を形成することを見出した。またmimRNAgの一部がRNP顆粒の一種Processing body（P-body）と部分的に共局在することがわかった。本年度は、mimRNAgとP-bodyが部分的に共局在する生理的意義を調べた。P-bodyの形成が著しく低下するEDC3破壊株においては野生株と比較して、mimRNAgの形成数が優位に低下していたこと、AOD1やDAS1の転写量が減少していたことなどから、P-bodyがmimRNAgの細胞内局在を時空間的に制御することでメタノール誘導性遺伝子発現を調整することが示唆された。
加えて、メタノール誘導性酵素の分解機構の解明にも取り組んだ。メタノールにより顕著に発達するペルオキシソームは、細胞をエタノールやグルコースなど他の炭素源を含む培地にシフトすると、不要となり選択的なオートファジー分解（ペキソファジー）を受ける。ペルオキシソームで働くAODおよびDASなどの酵素については、ペキソファジーの際にオルガネラごと分解されるが、細胞質で機能するFLDなどの分解機構は不明である。生化学的な解析により、ペキソファジー誘導条件下においてFLDがオートファジーにより液胞へと運ばることを示唆するデータを得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1960年に端を発するC1酵母研究を俯瞰すると、代謝経路の解明を含めた基礎研究から有用物質生産などの応用研究まで多岐に渡ることが見て取れる。中でも、発現誘導機構やプロモーターの機能解析など転写量制御に関する知見は数多く得られ、工業レベルでの生産にも応用利用されてきた。また、C1酵母を用いて、ペルオキシソームの合成と分解における分子機構の詳細も明らかになりつつある。しかし、転写以降におけるmRNAとタンパク質の細胞内制御については、ペルオキシソーム局在タンパク質がオルガネラの一部として分解されること以外未解明な部分が多い。
本年度の研究から、RNP顆粒の一種P-bodyがmimRNAgの細胞内動態を時空間的に制御することでメタノール誘導性遺伝子発現を調整していること、mimRNAの翻訳産物がオートファジーによる分解を受けることがわかり、C1酵母の転写後における遺伝子発現調節機構解明に向けた基礎的なデータを得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は昨年度後半から取り組んでいる、メタノール誘導性mRNAとタンパク質両分子の可視化系を構築する。モデルとしては、DAS1 mRNAおよびDas1タンパク質を用いる。タンパク質の可視化には、エピトープタグ配列をN末端に付加し、翻訳後抗エピトープFabがその配列に結合することで蛍光を発する仕組みを利用する。これにより、1分子のmRNAが細胞質に輸送された後の一生涯を追跡することが出来る。このシステムを利用し、mRNAに転写された後の制御機構を分解に焦点を当て調査する。また、オートファジーによる細胞質酵素の分解機構を詳細に解析するためにAtg11やAtg30など選択的分解に必要な因子の欠損株において対象タンパク質の動態を解析する。加えて、液胞輸送されるmimRNAとタンパク質に結合する因子の解析を行う。
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