Elucidation of evolutionary and molecular basis of animal special functions based on genome information and its application to highly functional sensors

Research Project

Project/Area Number	22K19097
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 37:Biomolecular chemistry and related fields
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	小川智久東北大学, 農学研究科, 教授 (80240901)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	柴田弘紀九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (80315093)
Project Period (FY)	2022-06-30 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2023: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000) Fiscal Year 2022: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Keywords	ピット器官 / TRPチャネル / 加速進化 / ゲノム情報 / マムシ亜科毒ヘビ
Outline of Research at the Start	本研究は，マムシ亜科毒ヘビが特異的に持つピット器官受容体であるTRPチャネルの構造と機能，および進化を明らかにし，生物進化に基づく新規センサーデバイス開発に資する。そのため，ヒメハブゲノム解読によるTRPチャネル群の遺伝子構造と進化の解明，TRPチャネルタンパク質の機能解析，クライオ電子顕微鏡による構造解析と赤外線感受機構の解明を行う。特殊機能の作用機序の解明は，「加速進化のメカニズム」など動物進化のパラダイム的転換を図るものとなり，本研究を挑戦的研究として進める意義がある。
Outline of Annual Research Achievements	マムシ亜科ヒメハブ(Ovophis okinavensis)ゲノム解読によりTRPチャネル群の遺伝子構造を明らかにした。ハブの染色体レベルでのゲノム解読も進めて，それぞれの遺伝子について対応するオーソログ遺伝子を同定した。このうちピット器官に関係するTRPA1は，AUGUSTUSでのGene modelでは２５エキソンからなることを明らかにした。また，他のTRPファミリー（TRPV1,TRPV2,TRPV3,TRPV4,TRPM2,TRPM4,TRPM5,TRPM8など）を含めたゲノムでの遺伝子の比較による進化解析において，ハブゲノム解析ではPacBioロングリード（N50長15kb）55Gbを取得しアセンブリを行い、Hi-CとBionano Saphyrのデータを追加して、scaffoldingを行った。その結果、申請書に記載した染色体スケールのアセンブリには成功したが，その後のさらなるmanual curationの結果、高度に遺伝子重複を起こしている領域には、いまだ欠落が存在していることが判明した。 TRPファミリーのトランスクリプトーム解析により，TRPファミリーのハブ組織での発現プロファイルを明らかにした。TRPA1は，ハブの胎児由来培養細胞にも他に比べて発現していることを明らかにした。AUGUSTUSでのGene modelによる推定配列とは別にTRPA1の実際の機能構造を明らかにした。ハブTRPA1のAUGUSTUSでのGene modelによる解析データをもとに人工遺伝子を作成し，p426ADH（構成型）とp426GAL（誘導型）の2種類のプラスミドベクターに導入後，ハブTRPA1の酵母での発現系を構築し，発現を検討した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 上述のようにPacBioロングリード（N50長15kb）55Gbと、Hi-CとBionano Saphyrのデータを追加して行った染色体レベルでのハブゲノムの解析は，その後のさらなるmanual curationの結果、高度に遺伝子重複を起こしている領域には、いまだ欠落が存在していることが判明した。そのため，2023年度には，先進ゲノム支援において，Oxford Nanopore Technologies（ONT）による超ロングリード配列の取得の支援を新たに検討している。ハブTRPA1のAUGUSTUSでのGene modelによる解析データをもとに人工遺伝子を作成し，ベクターに導入後ハブTRPA1の酵母での発現系をp426ADH（構成型）とp426GAL（誘導型）の2種類のプラスミドベクターを用いて構築したが，発現確認のための手法が不十分であった。
Strategy for Future Research Activity	上述のようにPacBioロングリード（N50長15kb）55Gbと、Hi-CとBionano Saphyrのデータを追加して行った染色体レベルでのハブゲノムの解析は，その後のさらなるmanual curationの結果、高度に遺伝子重複を起こしている領域には、いまだ欠落が存在していることが判明した。そのため，23年度に先進ゲノム支援において，Oxford Nanopore Technologies（ONT）による超ロングリード配列の取得の支援を内容とした申請を計画している。複雑に重複している遺伝子クラスター領域が完全に解明したゲノムアセンブリを整備することで、本科研費課題の対象であるピット（赤外線感知器官）機能の解明につながるだけでなく、ChIP-seqやATAC-seqなどの手法が可能になるため、ピットや毒腺などのハブ組織での特異な遺伝子発現調節システムの解明が大幅に推進できると期待される。酵母での発現系構築を行なったが，実際に発現を確認するための抗体を調製するか，Flagタグ配列を導入し，酵母での発現量の解析を含めて進める。