| Project/Area Number |
22K19288
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
松本 雅記 新潟大学, 医歯学系, 教授 (60380531)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | プロテオミクス / タンパク質間相互作用 / タンパク質構造 / 質量分析 / 蛋白質構造状態 |
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| Outline of Research at the Start |
ほとんどのタンパク質は細胞が置かれた状況に応じて局在や構造状態が変化し、活性などの機能が影響される。しかしながら、その全体像を迅速かつ定量的に見る手段は存在しないため、未だ想像の域を出ない状況にある。本研究では膜透過性ビオチン化試薬を用いたin situビオチン化プロテオミクス(ISBP)を確立し、細胞内でのタンパク質存在状態を迅速かつ定量的にモニターする技術を確立する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では細胞内のタンパク質状態の網羅的計測技術の開発を目的とする。ほとんどのタンパク質は細胞内で他のタンパク質と相互作用したり、リン酸化などによってその構造状態を変化させたりしていると考えられる。例えば哺乳類細胞の有糸分裂期の細胞は、細胞核膜は消失や微小菅などの細胞骨格の再構成など極めて劇的な形態変化が認められるが、このような状況下では、細胞全体にわたってタンパク質の状態変化が生じていると思われる。しかしながら、その実態を迅速かつ網羅的に見る手段は存在しない。そこで、膜透過性ビオチン化試薬を用いたin situ ビオチン化プロテオミクスを確立し、既存の相互作用プロテオミクスの手法を適用した結果と比較することで、各ビオチン化部位の変化の構造的な意義付けを行い、迅速に細胞内タンパク質状態をモニターする技術の確立を試みる。
今年度は、非変性条件下でのサイズ排除クロマトグラフィーや密度勾配遠心法とdata-independent acquisition (DIA)法による高スループット高深度プロテオミクスを組み合わせることで、大規模なタンパク質相互作用マップの構築を実施した。データ解析法としては、既知の複合体上へ同定結果をマップするツールであるCCprofilerと新規複合体同定ツールであるPCProhetを利用して多数の複合体および新規相互作用を同定した。さらに、昨年度取得したin situ biotylation proteomicによるプロテオーム状態データとの比較を行なった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本研究では独自に考案したin situ biotinylation proteomic法の構築と、そのデータ解釈のための共溶出プロテオミクスによるタンパク質間相互作用マップの作成と照合が主要な開発内容である。共溶出プロテオミクスでは大量の質量分析測定を実施する必要があるが、本年度は約3ヶ月にわたる装置の不調によってデータ取得に遅れがあった。また、データ解析ツールは既存のオープンソースのソフトウェアを利用しているが、我々の環境でそのまま稼働させることができず、いくつかの修正を行う必要があり時間を要した。本研究が目指す技術基盤開発自体は滞りなくできたが、これを用いたデータ取得や解析に時間を要したため、結果の解釈や成果の取りまとめに遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで技術基盤の開発には特に問題がなかったが、データ解析や解釈をより正確に行うために新たな実験を実施する必要が出てきた。本研究では一回のデータセット取得に数百の測定を必要とするため質量分析計の安定運用が必要不可欠である。そのため、経年劣化による消耗の可能性があるパーツの交換やメーカーによるメンテナンスの頻度を上げることで大量データを安定に取得することに努める。また、データ解析には計算時間がかかるため、複数のサーバーで並列解析するなどの方策を立てる。
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