| Project/Area Number |
22K19488
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 52:General internal medicine and related fields
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
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| Keywords | ハイスループットスクリーニング / 次世代シークエンス / ミスセンス変異体 |
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| Outline of Research at the Start |
網羅的変異タンパク質安定性解析という新たな研究スキームの確立を目指して、下記の研究項目を推進する。
(1)GFP融合ランダム変異体のハイスループット表現型スクリーニング: 変異体の細胞発現とフローサイトメーターによる蛍光強度を指標としたタンパク質安定性評価と細胞分取
(2)次世代シークエンスによる変異体の配列決定: ショートリードとロングリードシークエンスの利点を生かした、多数の変異体のコーディング領域全長の配列決定
(3)無～低発現変異体の発現実験での確認と既知バリアントデータとの相関の検証: 実験系の感度と特異度を、細胞での発現実験と既知バリアントデータから検証
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| Outline of Final Research Achievements |
In this study, we established a high-throughput screening analysis system to assess missense variants impacting protein stability by expressing a GFP fusion protein. Upon creating 104 clones of GFP fusion random mutants and conducting fluorescence evaluation and sequencing on 24 of them, we observed that fluorescence intensity remained consistent even in clones harboring 7 variants with high pathological prediction scores. This underscores the notion that in silico pathological prediction scores serve merely as reference points, emphasizing the crucial role of functional evaluation.
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| Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements |
遺伝子解析において、1アミノ酸の置換に過ぎないミスセンスバリアントは病的意義不明のバリアントと分類されることが多く、その機能評価が重要な課題となっている。本研究で確立した蛍光強度に基づいたタンパク質安定性のハイスループットスクリーニングは、遺伝子産物でも適用可能であり、かつ特別な機器を必要としない。この挑戦的研究によりProof of Conceptとなる研究成果を得ることで、希少疾患の原因遺伝子においてミスセンス変異タンパク質の安定性データベースが多くの研究者によって構築され、分子構造の理解とバリアントの解釈に大いに貢献することが期待できる。
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