Establishment of a natural rubber synthesis system using undifferentiated rubber tree cultured cells

• Project/Area Number: 22K19883
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 64:Environmental conservation measure and related fields
• Research Institution: Rikkyo University (2023); Institute of Physical and Chemical Research (2022)
• Principal Investigator: 栗原 恵美子 立教大学, 理学部, 助教 (90639585)
• Project Period (FY): 2022-06-30 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2023: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2022: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
• Keywords: 天然ゴム / ゴム培養細胞 / メタボロミクス / ケミカルバイオロジー / メタボローム / シングルセルメタボローム / 培養細胞

Outline of Research at the Start

我々の生活に欠かせない天然ゴムの生産について理解し，資源を守るために，本研究では,未分化なゴムノキの培養細胞に対して,低分子化合物処理やゴム合成関連遺伝子の導入を行い,対応する細胞内代謝物質プロファイルを取得することで未分化培養細胞内にゴム粒子を誘導すること,ひいてはゴム合成メカニズムの一端の解明を試みる．

Outline of Annual Research Achievements

天然ゴムとは一部の植物が合成することのできる長鎖ポリイソプレンである．天然ゴムの安定的な供給のために，ゴムの増産やゴムノキによらないゴム生産が求められているが，長鎖ポリイソプレンの合成に必須な因子やそれらのメカニズムについてはほとんど解明されていない．
本研究では，代表者が独自に確立した未分化なゴムノキの培養細胞を用いて，化合物の処理，もしくは必須と予測されるゴム合成関連遺伝子の導入などを行っていき，対応する細胞内代謝物質プロファイルを取得し，未分化培養細胞内にゴム様粒子（成分としてはポリイソプレン）を誘導することができるか検証することを目的とした．昨年度までにゴム様粒子を誘導する化合物A2の作用機構を行った。また蛍光タンパク質遺伝子を融合させたゴム合成関連伝子<I>CPT，CPTL，REF，SRPP</I>をパーティクルガン法でゴム細胞へ遺伝子導入し，それぞれの局在および挙動を解析した．当初の計画ではこの方法により遺伝子導入した細胞に対応したシングルセルメタボローム解析を行う予定だったが，必要量のサンプルが取得できなかった.そこで，今年度はゴム培養細胞にPEG（ポリエチレングリコール）法による遺伝子導入を試みた．その結果，パーティクルガン法と比較して効率よく蛍光で標識された細胞が確認できた。この細胞を回収し，pyro-GC-MSによるイソプレン含量の解析を行った．また，より高効率な遺伝子導入法として、恒常的な発現細胞の作出を行っている.現在，蛍光標識をした<I>CPT，CPTL</I>融合遺伝子のコンストラクションおよびアグロバクテリウムへの形質転換までが完了し，現在ゴム培養細胞に感染を試みている．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度まで行っていたパーティクルガン法での目的遺伝子の一過的導入だが，効率の低さが問題となり，メタボロミクス解析を行うだけの予備実験・サンプル調製まで至ることができなかった．今年度はより効率の高い形質転換法として，PEG（ポリエチレングリコール）法をゴム細胞でも適用することができることを確認した．これにより20-30%程度の細胞においてゴム合成関連遺伝子の導入ができ，対応する細胞のイソプレン含量を測定することができたため，概ね目的は達成できたといえる．

Strategy for Future Research Activity

PEG法による遺伝子導入はパーティクルガン法と比較すると高効率に遺伝し導入できることが明らかにった。しかしながら,割合は20-30％程度であった.PEG法による細胞の形質転換は大容量の細胞に対して行うには限界があること,導入効率の改善は本研究の課題である．そこで，PEG法での遺伝子導入効率の改善の検討およびデータ再現性取得を続ける．また，PEG法による遺伝子の導入により計測した値の信頼性・堅牢性を追求するために，アグロバクテリウム法による恒常的な発現細胞の作出を試みる．ゴム合成関連遺伝子の恒常的な発現をするゴム細胞株が作出できない場合は,形質転換法が確立されているタバコBY-2培養細胞やタバコ植物体などを用いて検証を試みる．

Research Products

• [Presentation] Single cell analysis for elucidation of natural rubber biosynthesis mechanism using rubber suspension cells (2023)
  • Author(s): Emiko Okubo-Kurihara, Emi Osada,Yuko Makita, Mika Kawashima, Hiroko Tsuchida, Ayato Sato, Naoya Kadofusa, Nanako Katou, Mayuko Sato, Mayumi Wakazaki, Kiminori Toyooka, Yuki Hamamura, MinamiMatsui
  • Organizer: 第64回日本植物生理学会年会
• [Presentation] ゴム培養細胞を用いたゴム生合成システムの解析 (2022)
  • Author(s): 栗原（大窪）恵美子, 長田恵美,蒔田由布子, 川島美香, 栗原志夫, 土田博子, 佐藤綾人, 角房直哉, 加藤菜々子, 浜村有希, 佐藤繭子, 若崎真由美, 豊岡公徳, 松井南1
  • Organizer: 第3回ゴム研究会