The non-canonical NF-kB pathway in regulatory T cells

Research Project

Project/Area Number	22K20868
Research Category	Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	0902:General internal medicine and related fields
Research Institution	Jikei University School of Medicine
Principal Investigator	佐藤洋平東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (50753349)
Project Period (FY)	2022-08-31 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	制御性T細胞 / NFKBシグナル / CRISPR /Cas9 / FOXP3 / NFκBシグナル / 可塑性 / CRISPR/Cas9
Outline of Research at the Start	制御性T細胞は生体内での免疫調整を担う細胞群であり、マスターレギュレーターのFOXP3を恒常的に発現することが知られている。制御性T細胞は、炎症性サイトカイン(IL-1β, IL-6等)の存在下でFOXP3の発現が不安定になり、エフェクターT細胞に戻る“可塑性”を持つことが知られている。NFκBシグナルは細胞増殖や分化に関わるシグナル伝達経路であり、ヒトやマウスではNFκBの遺伝的変異により、エフェクターT細胞や制御性T細胞の分化や機能が障害されることが知られている。古典的、非古典的NFκB経路をCRISPR/Cas9により制御することで、制御性T細胞の機能や表現型との関連を明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	ヒト末梢血からT細胞、並びに制御性T細胞を分離、NFKB1遺伝子並びにNFKB2遺伝子をCRISPR/Cas9を用いてノックアウトを行った。T細胞においては、NFKB1遺伝子並びにNFKB2遺伝子をノックアウトしても表現型に変化は見られなかった。制御性T細胞においては、NFKB1遺伝子をノックアウトしても表現型に大きな変化は見られなかったが、NFKB2をノックアウトした際にはFOXP3や関連遺伝子の発現が減少していた。そのため、制御性T細胞では非古典的NFKB経路が表現型の維持に関与している可能性が示唆された。 NFKB1並びにNFKB2タンパクはRELタンパク（RelA,RelB, c-Rel）と複合体を形成することで、シグナル伝達を司っていることが知られている。当初の計画ではNFKB1並びにNFKB2のみに着目する予定であったが、CRISPR/Cas9を用いたREL遺伝子（RELA ,RELB ,RELC）をノックアウトする事でNFkBファミリー遺伝子がどのように相互作用するかを検証することとした。CRISPR／Cas9によるNFkBファミリー遺伝子を網羅的にノックアウトする実験系を立ち上げ、セルラインやヒト末梢血から分離したT細胞、並びに制御性T細胞を用いた解析を行なっている。当初は造血幹細胞を用いてNFKB1遺伝子並びにNFKB2遺伝子をCRISPR/Cαs9を用いてノックアウトする予定であったが、動物実験の開始に時間がかかり、in vitroでの造血幹細胞のノックアウトに関する実験系は立ち上げたものの、年度内に動物実験までは行うことができなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の予定では2年間のうちにNFKB1、NFKB2をノックアウトすることにより、in vitroおよびin vivoの両側からアプローチをする予定であった。in vitroに関しては当初予定していたよりも早く実験が進み、RNA-seqを含めた機能解析を終了した。一方で、in vivoにおいてはノックアウトの実験系は順調に立ち上げられたが、免疫不全マウスの導入と造血幹細胞のノックアウト・移植のタイミングが合わずに実験開始を見合わせている状況である。しかしながら、他のNFkBファミリー遺伝子（RELA ,RELB ,RELC）をCRISPR/Cas9によりノックアウトする事で、NFKB1およびNFKB2以外のNFkBファミリー遺伝子が制御性T細胞の恒常性維持にどのように関与しているかを検証することとした。CRISPR／Cas9によるNFkBファミリー遺伝子を網羅的にノックアウトする実験系を立ち上げ、セルラインやヒト末梢血から分離したT細胞、並びに制御性T細胞を用いた解析を行なっている。現時点ではNFKB2をノックアウトした時のような表現型に対する明らかな影響は見られないが、FOXP3遺伝子や関連遺伝子の影響が見られ、今後解析を進める予定である。
Strategy for Future Research Activity	NFKB1およびNFKB2以外のNFkBファミリー遺伝子（RELA ,RELB ,RELC）をCRISPR/Cas9によりノックアウトする事で、NFKB1およびNFKB2以外のNFkBファミリー遺伝子が制御性T細胞の恒常性維持にどのように関与しているかを検証することとした。CRISPR／Cas9によるNFkBファミリー遺伝子を網羅的にノックアウトする実験系を立ち上げ、セルラインやヒト末梢血から分離したT細胞、並びに制御性T細胞を用いた解析を行なっている。現時点ではNFKB2をノックアウトした時のような表現型に対する明らかな影響は見られないが、FOXP3遺伝子や関連遺伝子の影響が見られ、今後解析を進める予定である。