The Analysis of the mechanisms of the aging-mediated accumulation of CADASIL-mutated NOTCH3 protein
Project/Area Number |
22KJ0484
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Project/Area Number (Other) |
22J21148 (2022)
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Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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Allocation Type | Multi-year Fund (2023) Single-year Grants (2022) |
Section | 国内 |
Review Section |
Basic Section 47030:Pharmaceutical hygiene and biochemistry-related
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Research Institution | Chiba University |
Principal Investigator |
鈴木 翔大 千葉大学, 医学薬学府, 特別研究員(DC1)
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Project Period (FY) |
2023-03-08 – 2025-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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Budget Amount *help |
¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2023: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2022: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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Keywords | CADASIL / NOTCHシグナル / NOTCH3 / 血管平滑筋 / 細胞老化 / 脳微小環境 / Notchシグナル / 糖鎖修飾 / Fringe / ペリサイト |
Outline of Research at the Start |
遺伝性認知症CADASILの病因として、NOTCH3遺伝子の変異に加えて老化がある。これまでに血管周辺でのNOTCH3変異タンパクの蓄積が病態を進行させることが示唆されているが、老化が変異タンパクを蓄積させる分子機構は不明である。 申請者らは、NOTCH3変異タンパクがNOTCHの糖修飾酵素やリガンドによって引き起こされることを明らかにした。そこで、老化が糖修飾酵素やリガンドといったNOTCH3とは別の分子を介して、NOTCH3変異タンパクの蓄積を促すのではと考え、in vitro及びin vivo CADASILモデルを利用して、老化を介したNOTCH3変異タンパク蓄積機構の解明を目指す。
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Outline of Annual Research Achievements |
当該年度は不死化血管平滑筋細胞imSMCのNOTCH3 CADASIL変異株の樹立、NOTCH3の分解、及び平滑筋の機能解析を並行して行なった。変異株の樹立について、CRISPR/Cas9システムによる相同組み換えを利用して、imSMCのNOTCH3遺伝子にCADASIL変異として報告されているC185RまたはR182Cを導入した。限界希釈によってホモ及びヘテロ変異株を樹立した。 次にNOTCH3 C185R, R182C変異体の分解を定量した。変異株を単独培養条件下および、 JAG1リガンド発現細胞との共培養条件下で培養後にシクロヘキシミドを添加することでNOTCH3の分解を追跡した。 さらに、コラーゲンゲル培養法を用いてimSMC NOTCH3 C185R, R182C変異株の収縮能を定量した。また、分化・増殖能を定量した。いずれの解析にしても細胞株のクローン差が生じてしまったので、今後は複数のクローンを用いて実験する必要がある。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当該年度は血管平滑筋細胞のCADASIL変異細胞株が樹立できて機能解析まで進めたが、細胞株のクローン差が出てしまったため。
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Strategy for Future Research Activity |
複数クローンを採取して増殖能が同程度の細胞株で野生型とCADASIL変異型の機能を解析していく。
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Report
(2 results)
Research Products
(9 results)