To investigate the role and mechanisms of action of HOPX as a regulator of human HSC self-renewal

• Project/Area Number: 22KJ0751
• Project/Area Number (Other): 22J01223 (2022)
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Multi-year Fund (2023); Single-year Grants (2022)
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 栢森 健介 東京大学, 医科学研究所, 特別研究員(CPD)
• Project Period (FY): 2023-03-08 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2026: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2025: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2024: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2023: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: HOPX / 白血病幹細胞 / 急性骨髄性白血病 / AML / CRISPR/Cas9

Outline of Research at the Start

急性骨髄性白血病はその遺伝子変異の全容は見えつつあるが、未だに完治療法の解明には至らず依然として予後不良の疾患である。HOPXは白血病幹細胞分画で発現が高く、高発現ほど予後が不良と報告されているタンパクである。臍帯血由来細胞および白血病患者由来細胞を中心にHOPXのノックアウトおよび過剰発現を行い、それらが正常と比較してどのような変化をもたらすかを評価する。さらにそれらの変化がどのようなメカニズムにより引き起こされるのかを検討する。以上の過程からHOPXの役割を明らかにし、AMLの新規治療ターゲットとなりうるか確認する。

Outline of Annual Research Achievements

HOPXは正常造血幹細胞で高い発現を示し、より分化した血液細胞では低い発現を示す。また、急性骨髄性白血病(AML)患者においてHOPXの高発現は予後不良因子であり、HOPXは白血病幹細胞に特異的に発現していることが報告されている。本研究の目的は正常造血およびAMLにおけるHOPXの役割を明らかにすることである。まず、臍帯血由来の造血幹前駆細胞(CD34陽性細胞)に対して、CRISPR/Cas9により生じるIndelを利用しHOPXのノックアウトを行った。HOPXをノックアウトした細胞を用いて造血コロニー形成アッセイを行ったところ、3回目の連続プレーティングでHOPXをノックアウトした群でコロニー数が有意に低下していた。一方、CRISPR/Cas9とアデノ随伴ウイルス(AAV)を用いた相同組み換え修復(HDR)により臍帯血由来のCD34陽性細胞を遺伝子編集し、HOPXを過剰発現させた細胞を作成した。同細胞で同様に造血コロニー形成アッセイを行ったところ、コントロール細胞が2回目の連続プレーティングでコロニーを形成しなかったのに対し、HOPX過剰発現細胞は継続的にコロニーを形成した。以上よりHOPXは正常造血における幹細胞機能の維持に重要である可能性がある。また、AML患者由来の細胞において上述の方法でHOPXをノックアウトし、免疫不全マウス(NSG)へ異種移植を行った。移植6ヶ月後に全骨髄解析を行ったところ、HOPXノックアウト細胞はマウスへのキメリズムが上昇し、細胞周期におけるG0期の割合が減少していた。この結果はHOPX高発現のAMLは予後が不良という事実と一見して相反するが、HOPXのノックアウトにより細胞増殖速度が上昇し化学療法の感受性が高まったのであれば合点がいく。したがってHOPXはAMLにおいて化学療法の感受性と関わっている可能性があり、今後それらを確かめていく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

正常臍帯血由来の造血幹細胞に対するHOPXのノックアウトおよび過剰発現において表現系が得られており、想定通りの進捗と言える。

Strategy for Future Research Activity

HOPXはAMLにおいて化学療法の感受性と関わっている可能性がある。HOPXをノックアウトした患者由来AML細胞を免疫不全マウスに移植し、その後化学療法を行う。化学療法後にマウスに生着していたAML細胞がどのような挙動を示すか骨髄細胞の解析により比較する。また、今後はそれらの表現系が起こるメカニズムについて追求していく予定である。AML細胞株を用いたChIP-seqを行い、HOPXがどのような転写因子に関わっているかを明らかにし、得られた結果をもとにさらなる解析を進めていく予定である。