配列データベースを活用した酵素改変法酵素パーツリモデリング法の開発と検証

• Project/Area Number: 22KJ2586
• Project/Area Number (Other): 22J23864 (2022)
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Multi-year Fund (2023); Single-year Grants (2022)
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
• Research Institution: University of Shizuoka
• Principal Investigator: 小塚 康平 静岡県立大学, 薬食生命科学総合学府, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2023-03-08 – 2025-03-31
• Project Status: Declined (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000); Fiscal Year 2024: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2023: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2022: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 酵素改変 / 耐熱性 / 生産性 / 酵素設計 / 高機能化

Outline of Research at the Start

高機能な酵素を開発するためには、酵素改変の成功確率を上げる指針となるツールが必要である。本研究では、データベースに登録された膨大な数のアミノ酸配列データを活用した酵素改変ツールの開発と複数のモデル酵素で検証を行い、ツールの開発と有効性の評価に取り組む。

Outline of Annual Research Achievements

【コンセンサス設計法を基盤とした酵素パーツリモデリング法の開発】
令和4年度までに、コンピュータプログラム言語“Python”を用いて、実行可能なスクリプトのβ版を完成させており、L-スレオニン脱水素酵素 (TDH, NAD+依存型酵素で、L-Thr を基質とし、側鎖のヒドロキシ基の脱水素反応を触媒) を用いて7種類のパーツリモデリング酵素を設計し、ツールの有用性の検証を実験的に行っている。本年度は、上記β版スクリプトの改良を模索した。以下、その詳細について記述する。
【１.アミノ酸物理化学的パラメータの加味】対象酵素の類似配列を用いた配列保存性度は、各個数をカウントしたものであり、アミノ酸残基ごとの特徴は全く反映されていない。しかし、酵素を構成する20種類のアミノ酸には性質の違い、例えば疎水性度の高さや電荷の有無などが存在する。そこで、配列保存性度にアミノ酸物理化学的パラメータを加味し、性質の違いを重みとして加えることを検討した。まずは疎水性度に着目し、コンピュータプログラム言語“Python”を用いて、配列保存性度に疎水性度を加味した実行可能なスクリプトを完成させた。
【２.前後配列の保存性度の考慮】β版の実行スクリプトは、コンセンサス設計法を基に作られた方法であり、類似配列のアライメント結果から各残基に対して保存性度を考慮する方法である。類似配列のアライメント結果を観察していくと、対象残基周辺にGapが豊富であるなどアライメント精度が高いとは言い難いケースが存在する。アライメント精度が高くない領域において上記実行スクリプトを適用した場合に、アライメント誤差を単に反映してしまう可能性がある。そこで、変異導入を対象とする周辺残基の保存性度を考慮することで、アライメント精度の高い領域においての変異算出を可能にしたスクリプトに拡張した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和4年度の研究計画として予定していた、コンセンサス設計法を基盤とした酵素パーツリモデリング法の開発について、順調に実施できている。具体的には、各種パラメータと二次構造情報を加味した変異算出ツールの開発をした。
対象酵素のアミノ酸配列から予測される二次構造 (α-ヘリックス: H 領域、β-ストランド: E 領域、ループ: C 領域) で分割し、それぞれに変異を一定のルールで導入するコンピュータツール開発を行った。現段階では、導入する変異の算出は上記1, 2の実行スクリプトを組み合わせた。多くの酵素配列に本ツールを適用しつつ、その出力結果を確認しながらツールのバグ修正を進めており、研究計画①の大半を計画通り達成した。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度の研究計画として予定していた、コンセンサス設計法を基盤とした酵素パーツリモデリング法の開発について、順調に実施できている。
今後は、開発したコンピュータツールを基に酵素改変を行い、実験的に機能評価を行なっていくことで、ツールの検証を行なっていく予定である。検証の対象とする酵素は、現時点で2種類（Lスレオニン脱水素酵素、Lアミノ酸酸化酵素）を予定している。