ペリサイトを起点とした脳梗塞時での炎症反応の解明

• Project/Area Number: 22KJ3210
• Project/Area Number (Other): 22J00044 (2022)
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Multi-year Fund (2023); Single-year Grants (2022)
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 56010:Neurosurgery-related
• Research Institution: National Cardiovascular Center Research Institute
• Principal Investigator: 千代田 大尚 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 特別研究員(PD) (20886155)
• Project Period (FY): 2023-03-08 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: ペリサイト / 脳梗塞 / 炎症応答

Outline of Research at the Start

毛細血管を被覆するペリサイトは、正常時での神経組織における血液脳関門維持や血流制御に重要であるものの、神経組織傷害に対してどのような役割を担うのか、十分に理解されていなかった。
本研究では、時空間的オミクス解析を基に、一過的脳虚血によって生じる、コア領域・ペナンブラ領域・周辺領域での経時的なペリサイトを中心とした細胞間連関の分子ネットワークを明らかにするだけでなく、ペリサイト特異的な遺伝子機能調節により脳梗塞時におけるペリサイトの役割を解明する。これまでわからなかった、病態時のペリサイトの役割を明らかにすることで、脳梗塞の病態形成の全容解明と脳梗塞治療に対する革新的な治療法開発の実現を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

毛細血管を被覆するペリサイトは中枢神経組織における血液脳関門維持や血流制御に重要であることは良く知られているものの、脳梗塞を含む神経傷害に対してどのような役割を担うのかは十分に明らかにされていない。本研究では、時空間的オミクス解析を基に、一過的脳虚血よって生じる各傷害領域（コア領域・ペナンブラ領域・周辺領域）におけるペリサイトを中心とした急性期炎症機構と組織障害進展過程に焦点を当てて、細胞間分子ネットワークを明らかにすることを目的としている。
さらに本研究課題遂行を通して、ペリサイトを基軸とした脳梗塞における病態形成過程の全容解明と、脳梗塞治療に対する新たな治療法開発の実現を目指す。
本年度は、脳梗塞後の脳組織における各細胞腫ごとの遺伝子発現情報を得るための条件検討を実施した。脳梗塞後の空間オミクス解析に適した各細胞腫を識別可能な免疫染色条件を決定した。さらに、脳梗塞後の時空間的な組織炎症進展に関わる細胞間相互作用の分子実体の解明に向け、RNAscopeを用いた各傷害領域における各細胞腫マーカー、ならびに炎症性サイトカインの組織染色条件を決定し、炎症惹起因子の発現細胞の同定を試みた。さらに、次年度以降に解析開始予定であるペリサイト特異的なNF-κB経路遮断マウスの準備を完了させた。以上の研究成果より、本年度では組織障害時におけるペリサイトの炎症応答の役割解析を可能とする研究基盤を確立させた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の研究成果は、研究課題遂行にあたって要となる実験系の条件確立であり、概ね順調に進展していると評価できる。

Strategy for Future Research Activity

1) 組織切片から単一細胞をレーザーにより切り取る方法(レーザーマイクロダイゼクション)もしくは、光照射した領域の発現遺伝子を検出する方法(PIC法)を用いて得られた、脳梗塞後の時空間的な各細胞腫ごとの遺伝子発現情報を基に、各時間での細胞間相互作用をNicheNet法などのアルゴリズムを用いて解析し、炎症関連因子群が発現する細胞腫・領域・時期などを免疫組織化学染色法とRNA scope法で同定する。
2) ペリサイト選択的に、炎症調節因子であるNF-κΒ経路を遮断したマウスを用いて、脳梗塞後の遺伝子発現変動解析をおこなう。
3) ペリサイトでの炎症抑制化により脳梗塞後の病態が改善するかを、脳切片のTTC染色による梗塞巣面積測定や、マウスの前肢麻痺度合いによる神経症状スコアの定量評価により調べる。さらに、損傷度合いを調べるため、免疫組織化学染色法を用いて血管形態の破綻や透過性上昇、ミクログリアの形質変化、活性化アストロサイトによるグリア性瘢痕形成、免疫系細胞の浸潤などを解析する。
4) 遺伝子発現変動解析の結果を基に同定した、ペリサイトで特異的に発現する炎症惹起因子の候補分子を阻害薬や、siRNAによるノックダウン、中和抗体などで抑制化したマウスを用いて、脳梗塞後の病態が改善されるかを調べるために、脳梗塞後の梗塞巣面積と神経症状スコアにより評価する。さらに、候補分子の抑制化で病態軽減した場合、ペリサイト特異的遺伝子欠損マウスを作成し、病態解析ならびに損傷度合いを評価することで、その関与を明らかにする。