| Project/Area Number |
23K05963
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 46010:Neuroscience-general-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
宮本 章歳 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (60632924)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 抗体改変 / 小型抗体 / 超解像イメージング / 超解像顕微鏡 / 神経伝達 |
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| Outline of Research at the Start |
神経間の情報伝達を担う「シナプス」は記憶・学習の基盤である。シナプスでの情報伝達を効率的に行なうために、シナプスでは神経伝達物質の放出場所と神経伝達物質受容体が対合した構造 (ナノカラム) が形成される。つまり、ナノカラム形成がシナプス伝達の鍵である。しかしながら、ナノカラムの制御メカニズムは未だ分かっていない。ナノカラムの制御メカニズムの解明には、超解像レベルでシナプスを構成するタンパク質の分子局在を解析することが必要である。本研究では、無制限の多重染色が可能な超解像顕微鏡IRISを用いて、シナプスの構成タンパク質の網羅的な超解像分子マッピングを行い、ナノカラムの制御メカニズムを解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2024年度は、シナプス周辺タンパク質に対する解離抗体プローブを新たに約10種類開発することに成功した。その結果、累計で50種類以上のシナプス周辺タンパク質の超解像イメージングを行える体制が整った。その中には、ナノカラム形成において重要な役割を担うタンパク質であるTenm3なども含まれている。さらに、タンパク質発現用の酵母株（Pichia株）を利用した解離抗体プローブの大量精製法の確立など当初の研究計画にはなかった成果もあげた。
また、海馬初代培養細胞系でのシナプスの位置を特定するために、FM色素を使って神経終末を可視化する方法も確立し、より詳細にシナプス周辺タンパク質の局在を観察できる体制を整えた。
さらに、これまで凍結切片やホルマリン固定パラフィン包埋切片（FFPE）切片での超解像イメージング法は確立していたが、新たに形態組織学的な検査で主に使われるHE染色切片を使った超解像イメージング法も2024年度に確立することに成功した。そして、実際にHE染色切片で7種類の解離抗体プローブを使った超解像画像も取得した。
2024年度は、これまでに作製した解離抗体プローブを使って、海馬初代培養細胞系および組織切片での超解像イメージングを網羅的に行い、具体的なナノカラム形成機構の解明に着手できるようになった。
さらに、超解像画像を構築する上で重要な位置補正に関しても、従来の解析プログラムに改良を加え、10ナノメートル弱の誤差での超解像画像を作れるようになった。このように、2024年度は当初の成果をあげることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
超解像イメージングに必要な解離抗体プローブの開発が予想以上に順調に進んでおり、これまでに40種類以上の解離抗体プローブを開発した。さらに、解離抗体プローブの大量精製法も確立することで、より効率的に多重超解像イメージングを行う体制が整った。
また、海馬初代培養細胞系でのシナプスの同定法や脳組織切片（HE染色切片）を用いた多重超解像イメージング法も確立し、標本の種類を問わずに多重超解像イメージングできるようになったことは大きな進捗である。
また、超解像画像を構築をする上で重要な位置補正に関しても、従来の解析プログラムに改良を加えることで、10ナノメートルレベルという従来の超解像画像の精度を超える画像を作製できるようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、海馬初代培養系およびマウス脳切片を使って、発達段階でのシナプス構成タンパク質の局在パターンを超解像イメージングすることで、ナノカラムの形成メカニズムの解明に挑む予定である。具体的には、まず海馬初代培養系を使って解離抗体プローブによる超解像イメージングを行い、培養日数に応じたシナプス構成タンパク質の変遷を明らかにする。その中で特に、ナノカラムを形成する分子群がどのようなタイミングで集合するのかを解明する。そして、同様のタンパク質群の変遷がマウス脳でも実際に起こっているのかを、様々な週齢のマウスの脳組織切片を使った超解像イメージングによって検証する。
マウス脳切片でのナノカラム形成の様子を超解像解析する方法が確立できれば、記憶・学習実験と組み合わせることで、記憶・学習の形成メカニズムにおいてナノカラムがどう関わっているのかの検証する。
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