相分離液滴のオートファジー分解効率を規定する構造基盤の解明

Research Project

Project/Area Number	23K06065
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	能代大輔北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助教 (90751107)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2027-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000) Fiscal Year 2026: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	オートファジー / 高速原子間力顕微鏡 / 液―液相分離 / ポリユビキチン / 天然変性領域
Outline of Research at the Start	液―液相分離して生じる相分離液滴は多彩な細胞内現象と関連している。哺乳細胞において、選択的オートファジーによるポリユビキチン化凝集タンパク質の分解に関わるp62は相分離液滴を形成するが、適切に隔離膜に包まれ分解されるためにはその液体度が重要である。多くの相分離タンパク質と同様に、p62やp62液滴構成因子は柔軟性の高い天然変性領域を含み、他の分子との多価の結合部位を持つ。液体度の異なる液滴の構造や隔離膜との相互作用を明らかにすることは特定の疾患の根本を理解する上でも重要である。本研究では高速原子間力顕微鏡やcryo電子顕微鏡によってこれらを可視化し、液滴選択性の構造基盤を明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	オートファジーは、タンパク質やオルガネラ等の細胞内成分をリソソーム（酵母では液胞）で分解する機構である。オートファジーが開始されると、隔離膜と呼ばれる脂質膜構造が現れ、膜が伸長して分解対象物を取り囲む。オートファジーには、主に飢餓時に誘導される非選択的な機構以外に、特定のタンパク質やオルガネラを選別して分解する機構（選択的オートファジー）が存在する。哺乳類では、p62タンパク質がポリユビキチン化された凝集タンパク質の分解に関わるが、p62複合体が液―液相分離して液滴（相分離液滴）を形成すること、液滴が適切に隔離膜に包まれるためには、その液体度が重要であることが明らかにされてきている。液滴構成分子による液体度の変化、液滴構成分子同士の相互作用、および隔離膜との相互作用などの構造基盤を明らかにすることを目的として本研究を開始した。現在までに、ヒトのp62液滴構成因子のタンパク質の調製がおおむね完了した。また、酵母に関して、様々な選択的オートファジーレセプタータンパク質を認識する部位を有する足場タンパク質Atg11の全長およびヒトにおける機能ホモログであるFIP200を高速原子間力顕微鏡で観察し、両者の類似した形状を明らかにしている。また現在までに、Atg11とAtg17-Atg29-Atg31複合体を混合して観察し、Atg11のN末端とAtg17-Atg29-Atg31複合体の末端部分が相互作用している様子を捉えた。AlphaFold3によってこれらの複合体構造予測をしたところ、Atg29C末端領域の一部がAtg11N末端の湾曲した部分に結合する予測結果を得た。さらに、アフィニティタグ標識したAtg11N末端とAtg29C末端を調製し、両者が結合することをプルダウンアッセイによって示すとともに、変異導入体を作製し、両者の相互作用において重要な部位を明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ヒトの選択的オートファジーに重要なタンパク質の調製はおおむね完了した。また、酵母のオートファジーに関して、Atg11とAtg29の相互作用に関する知見も得ることができた。
Strategy for Future Research Activity	Atg11-Atg29相互作用に関しては、生体内における意義について酵母を用いて調べる予定である。 p62タンパク質複合体については、液滴内構成因子の存在が液滴の形状や柔らかさにどのような影響を及ぼすか、また、液滴の柔らかさと液滴―脂質膜間相互作用の関係について、高速原子間力顕微鏡と蛍光顕微鏡を用いて調べていく予定である。