DNM3os/miR-214による線維化・炎症の制御を介する糖尿病性腎臓病の病態制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	23K07708
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 53040:Nephrology-related
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	村越真紀順天堂大学, 医学部, 准教授 (60599249)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	萩原晋二順天堂大学, 医学部, 非常勤講師 (70445568)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2025: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	マイクロRNA / 糖尿病関連腎臓病 / RAGE / 糖尿病性腎臓病 / 腎線維化
Outline of Research at the Start	慢性腎臓病（CKD）の中で最も頻度の高い糖尿病性腎臓病（DKD）の治療の確立は重要である。DKDの病態生理には、腎血行動態の変化、酸化ストレスの増加、炎症などが関与している。すべての経路の組織学的レベルでの最終段階は線維化である。これまでに、DKDの進行を遅らせるために、臨床的に有用な抗線維化薬は開発されていない。miRNAは遺伝子発現転写後抑制因子として働く18-22ヌクレオチド長の小さな非翻訳RNA分子である。本研究では、私たちがこれまでに腎臓の線維化に関与すると報告してきたmiRNAの、新規DKD治療薬としての可能性を検討する。
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、miR-214が線維化や炎症の制御を介して糖尿病関連腎臓病（DKD）の病態にどのように関与するか明らかにし、新たなmiRNAベースの創薬の開発を目指すことを目的としている。前年度には、高ブドウ糖液下で培養した野生型メサンギウム細胞（MC）およびRAGEノックアウトMCに対して、miR-214mimicまたはAnti-miR-214をトランスフェクションし、線維化および炎症に関与する遺伝子やタンパク質の発現をqPCRおよびWestern blotにより解析した。その結果、miR-214の過剰発現は線維化関連遺伝子およびタンパク質の発現低下を引き起こし、RAGEノックアウトMCにおいてmiR-214のノックダウンは、線維化および炎症関連遺伝子の発現を上昇させることが明らかとなった。さらに、miR-214の標的遺伝子としてRAGEと結合し下流のシグナル経路活性に関与するDiaph1を同定した。今年度は、細胞実験において、野生型ＭＣにアデノウィルスベクターを用いてmiR-214の宿主 primary transcriptであるDnm3osを過剰発現させ、線維化および炎症関連遺伝子およびタンパク質の発現変化を解析した。動物実験では、10週齢のDKDモデルマウスを2群に分け、miR-214疑似薬またはmiR-非標的薬をmiRNA導入試薬を用いて4週間投与した。投与後、各群の腎組織を採取し、組織学的に線維化の程度を評価するとともに、miR-214の発現変化および線維化・炎症関連遺伝子の発現をqPCRにより定量解析し、比較検討を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 前年度は、細胞実験については計画通り進んだが、動物実験については、当初の投与方法だと約2/3のマウスが水腎症を発症し、研究の継続が困難となり投与方法を見直した。今年度は、細胞実験で、Dnm3osの過剰発現が野生型MCにおいて線維化および炎症関連遺伝子の発現を上昇させることが確認された。さらに、公開データベースの解析によりDnm3osとDiaph1の相互作用が予測されたため、in situ hybridizationを用いて両者の細胞内局在を評価したところ、細胞核内での共局在が認められた。これらの結果から、miR-214とその宿主遺伝子であるprimary transcriptのDnm3osが、Diaph1を標的として線維化をそれぞれ抑制的および促進的に制御する可能性が示唆された。動物実験については、今年度に投与方法を改良したことで、DKDモデルマウスに対し、効率的にmiR-214疑似薬を投与することが可能となった。現在、腎組織のRNA発現解析により、miR-214疑似薬投与群の腎組織でmiR-214の発現上昇が確認されている。
Strategy for Future Research Activity	１．DKDモデルマウスのおける解析：DKDモデルマウスにmiR-214疑似薬またはmiR-非標的薬を投与し、腎組織を取得した。投与期間中の表現型（体重、血糖値、アルブミン尿など）に有意な差は認められなかったが、腎組織においては炎症および線維化に関連する分子や、細胞実験で同定した標的遺伝子Diaph1の遺伝子またはタンパク質発現レベルの定量解析を進めている。２．ヒト腎組織における検証：今後、臨床応用を見据え、ヒトDKD腎組織におけるDnm3os、miR-214、およびDiaph1の発現解析を行い、RAGE–Diaph1軸に対するDnm3osとmiR-214の発現バランスと腎線維化との関連性を明らかにすることを目指す。３．研究成果の統合と発信：以上の動物実験およびヒト腎組織解析のデータに、前年度までの細胞実験結果を統合し、国際学術誌への論文投稿を予定している。