| Project/Area Number |
23K08764
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56030:Urology-related
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
黒川 覚史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (50468253)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神沢 英幸 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (00551277)
加藤 大貴 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (00620931)
西尾 英紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (10621063)
林 祐太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40238134)
安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153)
水野 健太郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (70448710)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | 尿道下裂 / 遺伝子 / 遺伝子導入 / 口腔粘膜 / 尿道下裂修復術 / アデノウイルス / Pip遺伝子 |
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| Outline of Research at the Start |
尿道下裂の治療法は外科的修復術であるが、補填組織の不足や生着不全により合併症が高率に起こる。私たちは、開発した尿道下裂モデル動物の遺伝子解析から尿道形成の候補遺伝子Pipを同定した。本研究では、欠損した尿道を修復する組織として口腔粘膜を使用する。口腔粘膜を培養し尿道形成の候補遺伝子Pipを導入することで尿道の性質を持ち合わせた口腔粘膜由来組織を作製し、尿道の補填に用いる新術式の開発を目標としている。そのため、以下の3つの研究を計画している。
ⅰ. 尿道形成の候補遺伝子Pipの発現ベクターの作製
ⅱ. 口腔粘膜の採取、培養と遺伝子導入
ⅲ. 遺伝子導入した口腔粘膜由来組織を補填する新術式の開発
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| Outline of Annual Research Achievements |
尿道形成に関わるPip遺伝子の発現ベクター作製を行っている。これまで行ってきた尿道形成の遺伝子解析から同定したラットPip遺伝子について、全長cDNAをサブクローニングしている。哺乳類の細胞内で目的遺伝子を発現できるように上流にプロモーター配列としてCAGプロモーターを使用する。また、遺伝子導入部位を同定するためのマーカータンパクeGFPを発現できるように、PipとeGFPのcDNAとの間にIRES (internal ribosomal entry site) 配列を挿入する。プラスミド内で作製した目的遺伝子配列をシークエンスし、全塩基配列について変異のないことを確認している。
次に、目的遺伝子配列を非増殖性アデノウイルスのゲノムDNA内に組み込みアデノウイルスベクターを作製する。コントロールベクターとしてeGFPのみを発現するベクターも作製する。非増殖性アデノウイルスは、ヒト5型を改変し増殖に必要なE1E3領域を欠失させたものである。作製したアデノウイルスベクターは、増殖に必要なE1領域を発現したHEK293細胞内でしか増殖できない。HEK293細胞にアデノウイルスをトランスフェクトし大量増殖させた後、アデノウイルスを培養細胞ごと回収し凍結・融解により細胞壁を破壊し、Adeno-X Maxi Purification kit (Clonetech社)のカラムクロマトグラフィーで精製する。 さらに、Adeno-X Rapid Titer kitを用いてタイター測定しウィルス溶液を調整する。感染力価を測定した組み換アデノウイルスベクターは、凍結保存する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
サブクローニングに時間を要しているためにやや遅れている。組み換え遺伝子配列が長いためにプラスミド内でうまく増殖できずに、色々なコンピテントセルを試していることで、長期間かかっている。コンピテントセルの種類だけでなく、増殖温度なども調整して、プラスミド内の目的遺伝子が変異しないように工夫している。増殖した目的遺伝子配列は、シークエンスし、全塩基配列について変異のないことを確認している。
一つ一つのステップを間違うことなく完了し積み上げて、次のステップへ進んでいく必要があるために、時間を要している。
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| Strategy for Future Research Activity |
サブクローニングにおける条件設定は最初が肝心であるために時間を要しているが、条件設定が決定できればあとは時間配分などの計画も立てやすく、軌道に乗せることができる。十分なクミカエアデノウイルスベクターを準備しつつ、同時並行で、口腔粘膜の採取、培養を進めていく予定である。コンフルエントになったらアクターゼで細胞を回収し、遠心分離で細胞ペレットとする。回収した細胞ペレットを分注・培養し細胞数を十分増殖させた後、コンフルエント48時間前の培養液内にアデノウイルスベクターを投与し、目的遺伝子を強発現させる予定である。
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