| Project/Area Number |
23K13882
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
奥田 綾 京都大学, 複合原子力科学研究所, 准教授 (80825646)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | タンパク質ライゲーション / 区分同位体標識 / マルチドメインタンパク質 / 中性子小角散乱法 |
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| Outline of Research at the Start |
タンパク質ライゲーションとは、タンパク質同士を繋ぎ合わせる技術である。この技術により安定同位体で修飾/未修飾のドメイン(特定の機能と構造を持つアミノ酸配列の領域)を繋ぎ合わせることで、区分同位体標識試料を調製可能である。本試料は特定ドメインに着目した構造解析を可能にする。しかし、マルチドメインタンパク質に適用できるような、機能と構造を保持したまま多段階で効率よくライゲーションする技術は十分に確立されていない。そこで酵素を用いた新規ライゲーション技術を確立し、幅広いタンパク質への適用を目指す。さらに、区分重水素化試料を調製して中性子の小角散乱測定による特定ドメインの選択的構造解析を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2024度は酵素を用いたタンパク質ライゲーションの実用化に向けて、まずは前年度から引き続きライゲーション産物の安定性の問題解決を進めた。ライゲーション酵素の極微量な残存により、ライゲーション産物はロットによって保存中や測定中に分解してしまうことがあった。本年度はライゲーション反応を確実に停止できるようなライゲーション酵素の機能を直接阻害する分子の探索を行った。ライゲーション酵素OaAEPの活性中心システイン及びヒスチジンを阻害する複数種の還元剤、SH基修飾剤、金属イオン、認識配列ペプチドを検討し、還元剤DTTと各種SH基修飾剤が非常に効率的にOaAEPの活性を阻害することを見出した。
幅広いタンパク質へ本ライゲーション技術を適用するために、認識配列の異なるライゲーション酵素であるButelaseについても発現、精製、活性化を行った。しかしながら、酵素自身の安定性や純度不良の問題から、このままではライゲーション反応に使用することは難しく、精製条件の再検討の必要性がある。また、様々な部位に様々な認識配列を付加した基質として新たにユビキチンの発現系を構築し、ライゲーション反応条件の検討を進めている。
さらに、酸化的フォールディング酵素ER-60の中性子小角散乱(SANS)法による溶液構造解析において必要な区分重水素化試料について、安定的かつ大量に調製出来るよう二段階ライゲーションと精製の工程をルーティンワークとして確立に成功した。前年度もドメイン選択-逆転コントラスト同調(DS-iCM)-SANSの測定を行っていたが、今年度も更なる純度と安定性が担保された区分重水素化試料を用いて測定に臨んだ。現在、前年度のデータと今年度のデータを併せて溶液構造の解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2024年度において完了を予定していた酵素を用いたライゲーション技術の確立については、ライゲーション酵素の機能を直接阻害する分子の探索が完了し、問題点の解決と実用化レベルの引き上げに至った。
幅広いタンパク質へ本ライゲーション技術を適用するための技術確立について、ライゲーション酵素Butelaseが純度や安定性の点から非常に取り扱いの難しい酵素であることが明らかになり、予定より少し時間を要している。しかしながら、本酵素の実用化は酵素の認識配列の許容性を上げるためには必須であるため、時間をかけて解決に注力するに値する課題であると考えられる。
また、最終目標である区分重水素化試料の中性子の散乱測定については、高純度かつ安定性のある試料調製をルーティンワークにまで確立することができ、今後他の試料へ技術適応についても期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2025年度においては幅広いタンパク質へ本ライゲーション技術を適用するための技術確立について、ライゲーション酵素Butelaseの調製方法の確立を最重要課題とする。特に安定性向上のために、精製や保存の際のグリセロールやアミノ酸などの添加物の検討を行う予定である。精製方法については、現在使用しているHisタグだけでなく、その他のアフィニティタグの検討も視野に入れている。
また、本酵素を適用する基質については前年度に発現系を確立済みであるため、酵素の調製が完了し次第、様々な条件でのライゲーション反応実験を行い、効率的なライゲーション反応に必要な構造と配列の一般的指標を確立する。
さらに、酸化的フォールディング酵素ER-60のDS-iCM-SANS測定によるドメイン選択的な構造解析についても、複数回の測定結果を用いた解析を引き続き進めていく。
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