ウシ胚における低温傷害の発生機序解明と低温保存技術への応用

Research Project

Project/Area Number	23K14071
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 42010:Animal production science-related
Research Institution	Iwate University
Principal Investigator	藤井貴志岩手大学, 農学部, 准教授 (60609105)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2024: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	ウシ / 胚 / 低温保存 / 低温傷害 / 微小管 / 活性酸素種 / カテプシンB / ミトコンドリア / リソソーム
Outline of Research at the Start	胚の非凍結低温保存法は、特別な機器や技術、液体窒素を必要としない他、凍結保存過程で起こる種々の傷害を回避でき、高い利便性と高受胎率が望めるウシ胚の保存法としてその潜在価値は高い。しかし、現行の非凍結低温保存法で安定してウシ胚を保存できる期間は短く、その実用場面は限られる。本研究では、低温環境下で引き起こされるミトコンドリアおよびリソソームへのストレスを介した微小管変性に着目し、ウシ胚における低温傷害の発生機序を明らかにする。また、その人為制御によるウシ胚の低温耐性向上技術の開発を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	2024年度は、ウシ胚における低温（4℃）傷害の発生機序を明らかにすることを目的に、体外受精由来のウシ新鮮胚および低温保存胚における微小管構成タンパク質であるβ-tubulin性状、活性酸素種（ROS）産生およびリソソーム内タンパク質分解酵素であるカテプシンB活性を比較解析した。新鮮胚および5日間低温保存した胚の48時間培養後の生存率は、それぞれ94.1%および47.8%、透明帯からの脱出率はそれぞれ88.2%および39.1%であり、いずれも新鮮胚と比較して低温保存胚で有意（P<0.05）に低い値を示した。また、低温保存胚の細胞数は、新鮮胚と比較して少なく、低温保存後の細胞増殖が抑制されていた。β-tubulinの蛍光免疫染色を実施したところ、新鮮胚と比較し低温保存胚においてβ-tubulinタンパク質の凝集塊の有意（P<0.01）な増加が認められた。また、低温ストレス（4℃、6時間）を与えた胚におけるROSレベルは、新鮮胚と比較して有意（P<0.05）に高い値を示した。さらに、新鮮胚および低温保存胚におけるカテプシンB活性に有意差はなかったが、低温保存胚ではカテプシンB活性が顕著に高い胚が散見された。以上の結果から、4℃の低温ストレスは、ウシ体外受精胚の微小管変性、ROSの過剰産生およびリソソームからの不必要なタンパク質分解酵素の漏出を引き起こすことが示唆された。また、微小管は細胞分裂において極めて重要な役割を担うことから、低温保存胚における細胞増殖能の低下は、β-tubulinタンパク質の凝集と関連する可能性が示された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ウシ体外受精胚の作出系の見直しや低温保存胚のROS検出の評価系の確立に時間を要し、研究の進捗はやや遅れている。現在は、これらの条件検討を終え、令和7年度の研究により予定の実験を遂行できる見込みである。
Strategy for Future Research Activity	2025年度は、低温保存液への抗酸化剤およびタンパク質分解酵素阻害剤の添加が、ウシ胚の低温傷害に及ぼす影響を解析し、ウシ胚における低温傷害メカニズムを明らかにする。また、抗酸化剤およびタンパク質分解酵素阻害剤等を用いたウシ胚の低温耐性向上技術について検討する。