| Project/Area Number |
23K14137
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
林 順司 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 講師 (20802101)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | 酵素工学 / 酵素 / 超好熱菌 / 構造生物学 / 脱水素酵素 |
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| Outline of Research at the Start |
先行研究において超好熱菌の色素依存性脱水素酵素 (Dye-DH)のバイオセンサー素子としての有用性を立証したが、見出した酵素は少ない。バイオセンサーの普及には食品・医療分野で求められる多様な基質を測定できる必要があり、新たなDye-DHの探索が不可欠である。本研究では色素依存性D-乳酸脱水素酵素 (DLDH)に着目した。DLDHの触媒機構・基質認識機構を構造生物学的に解明し、機能改変に繋がる情報を獲得することで、D-乳酸以外のD-α-ヒドロキシ酸類を測定できる新規人工酵素の創製を本研究の目標としている。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、高度耐熱性の色素依存性D-乳酸脱水素酵素（DLDH）の立体構造情報に基づき、基質特異性を改変し、D-α-ヒドロキシ酸類を測定可能な人工酵素を開発することである。本研究はバイオ電池やバイオセンサーの素子として有用な色素依存性脱水素酵素の人工設計技術の構築において重要な役割を果たすと考えられる。
これまでにAeropyrum pernix由来のDLDH(ApeDLDH)のFAD非結合型の構造情報の取得に成功している。2023年度は本酵素のFAD結合型の構造情報の取得を目指し、FADに対する親和性を向上させた変異酵素の作製と変異酵素のX線結晶構造解析に関する研究を展開した。本酵素に計8か所の変異を導入し、野生型酵素では約1mMであったFADに対するKm値を200倍に低下（Km=5uM）させることに成功した。また本変異酵素の結晶化にも成功し、FAD結合型構造の取得に成功した。構造解析により、本変異酵素では既知のFAD依存性酵素と同様にFAD のピロリン酸がループ構造により保持されていた。野生型酵素では本ループ構造がディスオーダーしており、ApeDLDHはこのループ構造の柔軟性が高く、FAD の結合性が極端に弱くなることが予想された。
また、本酵素のFADのイソアロキサジン環周辺には亜鉛が存在し、それをアミノ酸残基H380、H387、E424が取り囲むように配置されていた。さらにH425がその周辺に存在しており、本残基が触媒残基の可能性が高いと考えられた。これまでにDLDHの立体構造は大腸菌酵素で1例報告（Dym et al.,2000）されているが、本酵素のこれらアミノ酸残基もほぼ同様の位置に存在していた。しかし、大腸菌酵素では亜鉛の電子密度が得られていないことから、本研究でDLDHの触媒活性の発現に亜鉛が重要であることが初めて示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2023年度において、ApeDLDHのFAD結合型の構造取得に成功した。またFAD結合部位周辺の亜鉛を見出し、触媒残基も推定された。DLDHの構造情報は本酵素以外では大腸菌酵素のみであり、反応機構や基質認識機構などの詳細は不明である。本酵素の解析により、大腸菌酵素の研究では見出されていない亜鉛の情報が得られたことは、触媒機構の解明にとって大きな成果と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度は基質結合状態の構造を取得することで基質認識機構の解明を行う。既にFAD結合型の情報が得られているため、基質であるD-乳酸あるいはピルビン酸を加えた共結晶の作成を行う。また、H425の変異酵素を作製し、活性の変化を調査する。本研究を通して、これまで不明であったDLDHの触媒機構および基質認識機構を解明する。
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