| Project/Area Number |
23K14150
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
松林 英明 東北大学, 学際科学フロンティア研究所, 助教 (00853061)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
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| Keywords | アクチン / タンパク質化学操作 / タンパク質光操作 / リポソーム / 人工細胞 / 細胞運動 / アクチン細胞骨格 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、真核生物の主要な細胞運動機構である、アクチン細胞骨格によるアメーバ運動を、分子で再現し、その構築原理を明らかにすることを目指す。申請者が開発してきたアクチン重合の光操作系を細胞サイズリポソームの系に応用し、細胞運動時の極性をもったアクチン重合と力発生を再現する。さらに、細胞運動に必要な因子と物理条件の構成的理解に迫る。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細胞運動を構成的に理解することを目指している。本年度は、まず、細胞が運動する際に見せる非対称なアクチンの重合をリポソーム型人工細胞の内部で再構築することについて進展が得られた。アクチン重合の操作を可能にするために、アクチン重合核形成促進因子と化合物依存型タンパク質二量体化系や、光依存型タンパク質二量体化系とを組み合わせた手法について、細胞内で応用について共著論文として発表した。さらに、化合物依存型タンパク質二量体化系をリポソーム型人工細胞内で応用し、非対称なアクチン重合や膜変形が観察された。この結果について、BioRxivで報告した。光依存型タンパク質二量体化系をリポソーム型人工細胞内に応用した方法についても研究を進め、大きく進展した。特に、アクチンの局在を光で制御する方法とその条件が見出され、さらに、特定の条件において光刺激方向に脂質膜が突出する結果が得られた。今後、非対称なアクチンの操作による膜の突出について、最小因子の同定などさらに解析を進める予定である。また、細胞の運動原理の理解についても、細胞骨格機能の上流の制御に関わるPI3Kの解析から新たな知見が得られ、その成果を報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
主要な成果として、本研究の基盤技術であるアクチン重合の操作について、共著論文を発表した（PMID: 37734382）。またこの実験系をリポソーム型の人工細胞に応用し、結果をBioRxivで公開した（PMID: 37790449）。
研究で用いるアクチン結合タンパク質について、精製タグを改良し、複数種類のアクチン結合タンパク質を統一した精製タグと精製手順で精製できるよう実験系を構築した。論文投稿中である。 これまで６種のアクチン結合タンパク質について、この方法で精製できることが明らかとなり、それぞれのタンパク質について、蛍光分光器、超遠心、全反射顕微鏡などを用いた解析から各タンパク質の活性が確かめられた。
細胞運動の再構築については、リポソーム型人工細胞の実験系において、光刺激方向にアクチンが局在化する条件が見出された。さらに、実験系に加えるタンパク質の組み合わせとその濃度、脂質組成、溶液の浸透圧、ガラス基板の修飾条件、分子混雑因子の有無、なども検討することにより、光刺激方向に脂質膜が突出する結果が得られた。より詳細な解析を目指す目的で、アクチンの蛍光修飾分子の検討を行ったが、新たに検討したJanelia 646 修飾アクチンは、これまで用いてきた Alexa 647 修飾アクチンに比べて輝度が低い結果が得られ、検討を中止した。
PI3Kの新規制御機構については、PI3Kの制御サブユニットである p85beta のiSH2ドメインと、エンドサイトーシスのアダプター分子であるAP2とが結合することを、AlphaFold2の構造予測と、精製タンパク質を用いたプルダウンの解析から明らかにした（PMID: 38521786）。
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| Strategy for Future Research Activity |
脂質膜の突出について、最小因子の同定と、各タンパク質の至適濃度の探索を進める予定である。リポソーム型人工細胞での検討も進めるが、上記に加えて、より効率的な比較検討を行う目的で、マイクロビーズの滑走アッセイ系の再現を行う予定である。表面にアクチン重合核形成促進因子をコートしたマイクロビーズをアクチンとアクチン結合タンパク質が含まれる溶液に入れると、ビーズ表面のアクチン重合によってビーズが滑走することが知られている。ビーズの移動速度や溶液の粘性から、各条件でのアクチンの力発生の程度を定量することで、アクチンによる力発生に必要な因子とその濃度条件の最適化を図る。これらの実験で得られた知見を、リポソーム型人工細胞に応用し、各因子の膜変形や人工細胞の運動に対する寄与を解析するとともに、それらの原理解明を目指す。さらに、アクチン結合を追加することで、それらの因子の力発生や膜変形への効果を検証することを予定する。
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