グリア細胞の多様性が生み出される分子メカニズムとその生物学的意義

Research Project

Project/Area Number	23K14196
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 44020:Developmental biology-related
Research Institution	Nara Institute of Science and Technology
Principal Investigator	篠塚琢磨奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (70869023)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000) Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywords	グリア細胞 / 脊髄 / マウスES細胞 / in vitro神経分化 / Wntシグナル / Shhシグナル / ES細胞 / 分泌性シグナル因子 / 神経分化
Outline of Research at the Start	中枢神経系の発生では、神経前駆細胞から多種多様な細胞が産生される。発生中期以降にはグリア細胞が出現し、神経回路形成などの機能を担う。しかし、グリア細胞の多様性が生み出されるメカニズムは未解明のままである。そこで本研究では、マウス胚性幹細胞(ES細胞)の神経分化システムを利用して、特定のグリア細胞を作り分けることを試みる。また、これらのグリア細胞の間で遺伝子発現を比較することにより、各種細胞を特徴付ける遺伝子の同定を行う。さらに、同定した遺伝子の変異ES細胞を用いて特定のグリア細胞の機能を欠損させることにより、グリア細胞の多様性が生み出されるメカニズムとその生物学的意義の解明を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	中枢神経系の発生では、神経前駆細胞が時空間的に分化し、多様な細胞が産生される。神経発生初期の神経管ではWnt, Shhといった分泌性シグナル因子によってもたらされる位置情報に従って特定の転写因子が発現することで、神経前駆細胞の背腹軸に沿った領域化が起こる。これらの神経前駆細胞領域に対応して特定の神経細胞が分化することで神経細胞の多様性が生み出される。一方、神経発生中期以降には神経前駆細胞からグリア細胞が産生される。しかし、グリア細胞の多様性が生み出されるメカニズムはほとんど明らかになっていない。そこで、まず、in vitroで領域特異的な神経前駆細胞群、グリア前駆細胞群、グリア細胞群の計１２種類の細胞群をマウス胚性幹細胞（ES細胞）から作製した。これらの細胞群をもちいててRNAシーケンス法による網羅的遺伝子発現解析を行い、各領域の神経前駆細胞からグリア細胞への分化段階において発現が変動する遺伝子を明らかにした。次に、in vitroの解析で得られた遺伝子が実際にin vivoで発現しているのか確認するため、マウス胚を用いてin situ hybridization法によるmRNA発現解析や抗体染色法を行い、生体内において時期・領域特異的に発現する複数の遺伝子を同定した。さらに、得られた遺伝子の機能を解析するため、CRISPR/Cas9法をもちいて機能欠損ES細胞を作製し、それらの機能欠損ES細胞を分化させ、野生型ES細胞から分化させた細胞群と比較することで、遺伝子の機能解析を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason これまでに、マウスES細胞から特定の神経前駆細胞、グリア細胞を分化させる系を確立した。次に、それらの作製した細胞群でRNAシーケンスによる網羅的遺伝子発現解析を行い、各細胞群の遺伝子発現データセットを確立した。これらのデータセットから特定の細胞群で特異的に発現する遺伝子をリストアップし、in vivoでの発現解析を行い、実際に生体内で時期・領域特異的に発現する遺伝子を明らかにした。さらに、CRISPR/Cas9法をもちいて候補遺伝子の機能欠損ES細胞を作製した。このように本研究はおおむね順調に進行し、グリア細胞の多様性が生み出される分子メカニズムを解析するための研究の基盤が整った。
Strategy for Future Research Activity	in vitroで分化させた細胞群を用いて行った網羅的遺伝子発現解析によって得られた遺伝子発現データセットをもとに、生体内で時期・領域特異的に発現する複数の遺伝子を同定した。これらの遺伝子に関して、ES細胞においてCRISPR/Cas9法をもちいた機能欠損を行い、その遺伝子欠損ES細胞を分化させることで、領域特異的なグリア細胞の分化に関わる遺伝子の探索を行う。最後に、特定のグリア細胞が神経発生や神経機能に及ぼす影響を個体レベルで明らかにする。これらの研究により、多様なグリア細胞の分化メカニズムとその生物学的意義を明らかにする。