近位尿細管細胞特異的CyclinD1のDNA修復能を介した腎保護効果の解明

• Project/Area Number: 23K15249
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 53040:Nephrology-related
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 尾崎 陽介 広島大学, 病院(医), 医科診療医 (30963706)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2023: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: Cyclin D1 / DNA傷害 / 慢性腎不全

Outline of Research at the Start

近位尿細管細胞（PT細胞）は、低酸素や薬剤に暴露されやすい細胞であると共に、障害の頻度や重症度によって様々な腎障害の起点となる。そのため、障害によるPT細胞のシグナル伝達の変化やストレス応答の機序の解明が、腎臓病を克服するために必須である。申請者は、PT細胞特異的Cyclin D1ノックアウトにより、高血圧による腎障害が増悪することを明らかにした。しかし、Cyclin D1欠損が腎障害を増悪させる機序に関しては明らかになっていない。そこで本研究では、PT細胞のCyclin D1が、腎障害の進行に与える影響を明確にする。

Outline of Annual Research Achievements

近位尿細管細胞(PT細胞)は、低酸素や薬剤に暴露されやすい細胞であると共に、障害の頻度や重症度によって様々な腎障害の起点となる。そのため、障害によるPT細胞のシグナル伝達の変化やストレス応答の機序の解明が、腎臓病を克服するために必須である。申請者は、細胞周期調節因子であるCDK4/6-Cyclin D1複合体に着目し解析を行い、PT細胞特異的Cyclin D1ノックアウトにより、高血圧による腎障害が増悪することを明らかにした。しかし、Cyclin D1欠損が腎障害を増悪させる機序に関しては明らかになっていない。そこで本研究では、Cyclin D1が持つとされるDNA修復能に焦点を当て、PT細胞のCyclin D1が、DNA傷害を契機とする腎障害の進行に与える影響を明確にする。
今回、我々はCyclin D1を標的としたsiRNAを導入したHK2細胞に①造影剤及び放射線障害②アリストロキア酸を用いてDNA傷害を誘導し、Cyclin D1のノックダウンがDNA傷害やアポトーシスに与える影響の確認を行った。その結果、Cyclin D1をノックダウンしたHK2細胞においてDNA傷害マーカーが上昇していることが明らかになった。一方で、DNA修復に関わるRAD51などの蛋白の上昇がみられないことが明らかとなった。さらに、CyclinD1ノックダウン細胞においてアポトーシスが増強していることも確認できている。これらの結果は、CyclinD1の欠損によるDNA修復不全が細胞死を引き起こしていることを示唆している。また、CyclinD1のDNA修復能に関与する候補タンパク質の選定を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今回、scramble siRNAを導入したHK2細胞に比べ、CyclinD1を標的としたsiRNAを導入したHK2細胞において、2つのDNA傷害刺激(造影剤＋放射線照射、アリストロキア酸)でDNA傷害の強度に応じてアポトーシスが増強していることが確認できた。さらに、その機序として、Cyclin D1をノックダウンしたHK2細胞においてγH2X等のDNA傷害マーカーが上昇していることが明らかになった。一方で、RAD51、Survivin等のDNA修復に関わる蛋白の上昇がみられないことが明らかとなった。さらに、Cyclin D1のもつDNA修復能の機序として、Cyclin D1によって発現が誘導されるDNA修復に関わることが示唆される候補タンパク質の選定もできている。

Strategy for Future Research Activity

HK2細胞を用いた細胞実験では、Cyclin D1により誘導される、DNA修復との関連が示唆される候補タンパク質を選定している。その候補タンパク質とCyclin D1の相互作用に関して解析を行う。
動物実験に関しては、複数のDNA傷害モデルマウス(造影剤腎症モデル、アリストロキア酸モデル等)にCDK4/6阻害剤の投与を行い、その腎保護効果及びCyclin D1の発現の確認を行う。また、近位尿細管細胞特異的Cyclin D1ノックアウトマウスを用いてCyclin D1ノックアウトによる、腎機能への影響、DNA傷害、細胞死の評価を行う。また、細胞実験で選定した候補タンパク質の発現に関しても確認を行う。