人工神経におけるSchwann細胞スフェロイド技術の応用

• Project/Area Number: 23K15738
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 56020:Orthopedics-related
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 片岡 武史 三重大学, 医学系研究科, 寄附講座助教 (80942747)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2028-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2027: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000); Fiscal Year 2026: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000); Fiscal Year 2025: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000); Fiscal Year 2024: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
• Keywords: 人工神経 / Schwann細胞 / スフェロイド

Outline of Research at the Start

欠損の大きい末梢神経損傷は自家神経移植が行われるが、採取部の犠牲は不可避である。そのため神経再生誘導チューブが開発され利用されているが、2cm以内の感覚神経に適応される。神経再生誘導チューブの再生能の不足を補うため、Schwann細胞を播種したhybrid型人工神経の有用性が報告されている。本研究では細胞が有する機能を十分に発揮させることを目的として3次元培養したSchwann細胞スフェロイドを作成する。また人工神経の運動神経への応用も目指しSchwann細胞スフェロイド神経再生誘導チューブ内に播種することで、末梢神経オルガノイドを現実にする布石となるhybrid型人工神経を作成を目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は末梢神経再生における新たな人工神経を開発することである。従来から2次元培養したSchwann細胞を播種したhybrid型人工神経は、神経再生誘導チューブ単独よりも高い有用性が示されてきた。今回は細胞が本来有する機能を十分に発揮させることを目的として、3次元培養したSchwann細胞を用いる。その現実的な方法として細胞塊（細胞スフェロイド）に注目した。末梢神経再生においてSchwann細胞が主役であることは明白であり、再成軸索の足場となるSchwann管形成や、神経栄養因子を発現する。末梢神経再生にスフェロイドを用いた研究はないが、単層培養細胞よりSchwann細胞の機能を強く発揮することは間違いないと思われる。
まずrat Schwann細胞（SciencellTM, CA, USA; catalog #R1700）を用いてスフェロイドの作成を行った。Schwann細胞培養メディウムを用いて培養し、スフェロイドの作成はhanging drop 細胞培養法で行った。低接着試薬がコーティングされたスフェロイド形成培養用容器
（SPHERICAL Plate 5D, Mito, Kyoto, Japan）を用いてscaffoldを用いずにスフェロイド作成した。
作成したSchwann細胞スフェロイドをS-100抗体とDAPIを用いて蛍光免疫染色して蛍光顕微鏡下に観察を行い、スフェロイドの均一性を評価した。
また神経栄養因子発現の評価を現在行っている。作成したスフェロイドの細胞数と同数の2次元培養したSchwann細胞とを比較する。またタンパクをRIPA bufferにて抽出し、ELISAで神経栄養因子（NGF,BDNF,GDNF）の発現を確認している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和5年度はSchwann細胞スフェロイド作成方法の確立を目指していたが、安定してたスフェロイド作成が可能となった。Schwann細胞スフェロイドからの神経栄養因子の発現も認めており、当初の予定通りに進んでいると考える。

Strategy for Future Research Activity

今後in vivoの実験を進めていく。SDラット（12週齢、オス）を用いて、大腿中央で坐骨神経の15mm欠損モデルを作成する。これに神経再生誘導チューブ（リナーブ;、ニプロ）を用いて架橋するが、その際に作成したSchwann細胞スフェロイドをチューブ内に封入する。モデルとしては神経再生誘導チューブのみの群、チューブ内にSchwann細胞スフェロイド封入群、チューブ内にGDNF添加Schwann細胞スフェロイド封入群、切除した神経による自家神経移植群を作成する。行動学的評価、トルイジンブルー染色での軸索数と軸索径測定、免疫組織学的検討、電気生理学的評価を行う予定である。