| Project/Area Number |
23K17992
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山岡 尚平 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (00378770)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2025: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | タンパク質間相互作用 / 植物細胞 / 化合物スクリーニング / ライブイメージング / 有性生殖 / 植物 |
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| Outline of Research at the Start |
植物の生殖過程に不可欠なタンパク質間相互作用を標的とする化合物は、新しい育種技術の開発につながると期待できる。本研究では、植物の配偶子形成・配偶体機能・重複受精などの有性生殖過程に関わるタンパク質間相互作用について、それらを植物体内で可視化したレポーター株を作成し、標的とする化合物を探索・同定する。本研究で開発する化合物スクリーニング法は、生殖過程のみならず、タンパク質間相互作用が寄与する植物のあらゆる生理過程に適用でき、高い汎用性が期待できる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、タンパク質間相互作用(PPI)の新規検出法であるFluoppi (Watanabe et al., 2017)に基づき、生きた植物細胞内でPPIの有無を検出できる新しいベクターをつくる。そして植物の生殖過程に関わるPPIを検出するレポーター植物を作出し、化合物スクリーニングを行うことで、そのPPIを標的とする「分子標的農薬」の候補となる化合物を得る。
本年度は、花粉管誘引に関わるペプチドLUREとその受容体PRK6のPPIを検出するベクターを作成し、一過的発現アッセイを行って、FluoppiによりPPIが検出可能であることを示した。また、昨年度までに作成した、生殖細胞分化に関わるbHLH転写因子BNB-LRLのヘテロ二量体形成におけるbHLHドメイン間のPPI、およびジャスモン酸(JA)シグナル伝達に関わる受容体COI1と転写調節因子JAZ1のJA関連化合物依存的なPPIを検出するベクターについて、一部のプロモーターを誘導発現型に換えたのち、シロイヌナズナの安定形質転換体を作出した。得られたラインについて、T2の分離比の検定とウェスタンブロットによりベクターのコピー数とレポータータンパク質の発現を確認したのち、交配を行った。現在、F1の育成を行っており、来年度にその中からFluoppiアッセイが可能な植物を選抜する。
また、自動播種装置と蛍光顕微鏡システムを用いて、384プレートでのシロイヌナズナ芽生えの育成と蛍光レポーターの半自動的な検出方法を検討した。その結果、比較的短時間で全個体での蛍光検出が可能な方法を見出した。来年度では上記で確立したFluoppiレポーター株を用いて検出条件の最適化を行った上で、化合物スクリーニングを実施し、新規化合物を同定する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の主目的のひとつである、花粉雄原細胞分化に関わるBNB-LRL、花粉管誘引に関わるLURE1-PRK6、ジャスモン酸シグナル伝達に関わるCOI1-JAZ1について、Fluoppiによる各PPIの検出が可能なことを示すことができた。また、レポーター植物の系統確立の見通しも得られたが、当初の目標であった本年度中での全てのPPIでのレポーター植物確立には至らなかった。一方、蛍光顕微鏡によるレポーターの検出システムについては開発を進めることができた。来年度はレポーター植物を用いた化合物スクリーニングを実施できると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度に、植物の有性生殖に関わる上記３つのPPIを検出するFluoppiレポーター植物の系統を確立する。COI1-JAZ1のレポーター植物を用いて、PPIの可逆性をFluoppiが検出可能であることを示すとともに、PPIの反応速度論的解析を行い、植物細胞でのFluoppiによるPPI検出法の具体例を示す。レポーター植物の系統確立を行い、Fluoppi蛍光の検出法の最適化を行う。化合物スクリーニングを実施し、上記３つのPPIに影響する化合物を探索・同定する。また、得られた化合物を用いて、植物個体・組織・細胞レベルでの生理作用を検証する。以上の成果を、植物におけるFluoppiレポーターシステム確立と、植物の有性生殖に関わるPPIに作用する化合物の同定と生理機能解析についてそれぞれ述べた２つの論文として発表する。
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