| Project/Area Number |
23K18084
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
前澤 創 東京理科大学, 創域理工学部生命生物科学科, 准教授 (90548174)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2025: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | 生殖科学 / エピゲノム / エピゲノム編集 / 分化誘導 / 配偶子形成 / クロマチン / 減数分裂 |
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| Outline of Research at the Start |
最近の研究から、配偶子形成の進行に重要なエピゲノムの制御機構についての知見が蓄積している。また、エピゲノム編集技術の発展により、ゲノムの特定の領域に対する人為的なエピゲノム制御が可能になりつつある。本研究では、哺乳類精子形成期の進行に重要なエピゲノム変動領域を標的に、ハイブリッドエピゲノム編集法を用いて人為的にエピゲノムを書き換えることにより、多能性幹細胞や精子幹細胞から精子を創出するための生体外精子形成技術の確立を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、エピゲノム編集技術を用いて胚性幹細胞や精原細胞から、精母細胞や精子細胞への分化誘導法の確立を目指している。哺乳類の精子形成期では、精原細胞の分化開始期、減数分裂期、および半数体期においてエピゲノムやクロマチン構造が大きく変化することで、分化段階特異的な遺伝子発現が制御されている。エピゲノムやクロマチン構造が変化するゲノム領域には特徴的なDNA配列モチーフが検出されるため、それらのゲノム領域を標的にエピゲノム編集を行うこととした。
前年度までに、マウス精巣を用いたscATAC-seqデータ解析からエピゲノム編集の標的領域の選定、および培養細胞を用いたレポーターアッセイにより、活性化型および抑制型のエピゲノム編集の実験系を確立した。
本年度は、活性化および抑制型のエピゲノム編集を同時に行う実験系の確立を進めた。dCas9を用いたCRISPRa法による活性化型エピゲノム編集、およびddCas12aを用いたCRISPRoff法による抑制型エピゲノム編集を、同一細胞内で実施するための条件を、レポーターアッセイを用いて検討した。分化細胞株を用いて、一過性発現系による活性化型および抑制型のエピゲノム編集を同時に実施する条件が見出されたため、内在性遺伝子を標的にしたエピゲノム編集を実施した。標的遺伝子発現の変化をリアルタイムqPCR法により解析したが、本年度終了時までに内在性遺伝子を同時に活性化および抑制化する条件は見出せなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予定では、内在性の遺伝子群を標的として、同時に活性化および抑制化を制御するエピゲノム編集の条件を見出すことを目的としていたが、達成できなかったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
分化細胞株を用いた内在性遺伝子のエピゲノム編集が困難だったため、今後は、幹細胞株を用いて条件検討する。また、エピゲノム制御因子に対する阻害剤添加や、分化誘導能が確認されているサイトカイン添加との併用を検討する。さらに、精原幹細胞株を用いてエピゲノム編集を実施し、精子形成過程の進行を分化マーカーの遺伝子発現変化や染色体形態変化を指標に評価する。
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