| Project/Area Number |
23K18210
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 49:Pathology, infection/immunology, and related fields
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
川口 寧 東京大学, 医科学研究所, 教授 (60292984)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | HSV / レポーターウイルス / 感染の不均一性 / ウイルス遺伝子発現 |
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| Outline of Research at the Start |
周知の通り、特定の刺激に対する反応の推移を解析する手法として、古くから経時的なサンプリング(=タイムコース解析)が、様々な分野の研究において採用されてきた。しかしながら、本手法は「刺激に対する応答が、ある程度均一に進行すること」という条件下でのみ妥当性が担保される方法論であり、複雑な要因が絡み合う生命科学研究において、最適な手法とは言い難い。したがって、本研究では、ウイルス感染サイクルをモデルに感染サイクルの駆動力そのものであるウイルス遺伝子発現依存的に感染現象の推移を、分解・解析する実験系を確立することで、感染現象の真の姿を紐解くことを目標とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
宿主細胞に侵入したウイルスは、自己ゲノムより規則的な順序でウイルス遺伝子を発現することで、子孫ウイルスを産生する。単純ヘルペスウイルス(HSV)感染細胞では、前初期遺伝子群、初期遺伝子群、後期遺伝子群といったカスケード状の遺伝子発現により、感染サイクルが厳密に制御されると考えられている。そして、ウイルス学では、この段階的な感染現象を解明するため、感染細胞を経時的にサンプリングするという手法が古くから用いられてきた。しかし、ウイルス感染細胞のシングルセル解析により、ウイルス遺伝子発現は細胞集団において不均一であることが周知の事実となっている。従って、ウイルス遺伝子発現の高い不均一性を鑑みると、ウイルス感染細胞の経時的なサンプリングから得られた知見は、モザイク状の進行状況にある感染細胞の平均的な姿(値)でしかなく、感染現象の各段階における真の姿(値)を反映しているとは考え難い。そこで本研究は、従来の感染時間依存的な方法から脱却し、感染現象の駆動力ともいうべきウイルス遺伝子発現依存的にサンプルを分取することで、従来法では不均一性に埋没していた感染現象の真の動態を明らかにすることを目的としている。本研究で実施するウイルス遺伝子発現依存的な細胞分取法を確立する為に、HSVゲノム編集法により前初期蛋白質にTagRFP、後期蛋白質にVenusを付加した組換えレポーターウイルスを作製した。本レポーターウイルスをHeLa細胞にMOI5で感染させ、感染24時間後にVenusの蛍光強度に基づき細胞を6つの分画に分取し、各分画の後期蛋白質発現量を質量解析にて解析した結果、Venusの蛍光強度とほぼ全ての後期蛋白質の発現量の間には強い正の相関関係が認められた。従って、本レポーターウイルス感染細胞におけるVenusの蛍光強度はグローバルな後期蛋白質発現量の指標となる事が明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当該年度までに、本研究で使用するレポーターウイルスを構築し、このレポーターウイルスの培養細胞における増殖力が野生株と同程度であることを確認した。また、このレポーターウイルス感染細胞におけるVenusの蛍光強度がグローバルな後期蛋白質の発現の指標となるという、本研究を遂行する上で基盤となる知見を得ることができた。従って、このレポーターウイルス感染細胞におけるVenusの蛍光強度に基づき細胞を分画し、包括的なウイルス学的解析を実施するという本研究の基盤が整った。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該年度で確立した感染細胞の分画システムを用いて、ウイルス遺伝子発現依存的に分取した各細胞集団を、(i)子孫ウイルス産生量の推移の解析、(ii)電子顕微鏡によるウイルス粒子成熟機構の解析、(iii)RNA-seqによるウイルス転写産物量の解析等の包括的な解析に順次供することで、感染細胞における後期遺伝子発現の進行に伴う子孫ウイルス産生量、ウイルス粒子成熟、ウイルス転写産物量の直接的な関係性を明らかにする。
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