| Project/Area Number |
23K18358
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 57:Oral science and related fields
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岩山 智明 大阪大学, 大学院歯学研究科, 助教 (80757865)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 幸裕 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (30636402)
村上 伸也 大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (70239490)
山下 元三 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (90524984)
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| Project Period (FY) |
2023-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
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| Keywords | 歯周組織再生 / PROTAC / 分子接着剤 / キメラ分子 / 転写因子 |
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| Outline of Research at the Start |
理想的な組織再生を達成するためには、組織幹細胞から組織を構成する細胞群への分化を効率的に誘導することが重要である。細胞分化は転写因子の働きにより制御されているが、転写因子は従来の創薬モダリティでは標的困難であった。そこで本研究では2つの任意のタンパク質への結合部位を持つ低分子化合物である分子接着剤に着目し、分子接着剤を用いた硬組織形成細胞の分化制御について解析を行い、新規治療法開発へとつなげる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
失われた歯周組織を効率よく再生するには、歯周組織構成細胞の増殖・分化に特徴的な転写因子を直接制御することが望まれる。本研究では、標的転写因子とユビキチンリガーゼを結合することで分解誘導する分子接着剤および標的転写因子と転写活性複合体を結合することで転写活性化する分子接着剤をそれぞれ合成し、分子接着剤を用いた硬組織形成細胞の分化制御について解析を行う。このために、①HaloTagノックイン細胞の作製とPROTACによるHaloTag標識転写因子の分解、②分子接着剤合成とin vitroおよびin vivo薬効試験、を遂行する。初年度は主に以下の結果を得た。
①HaloTagノックイン細胞の作製とPROTACによるHaloTag標識転写因子の分解
CRISPIE法（Zhong et al., eLife, 2021）を改良した手法により、骨芽細胞やセメント芽細胞に関連する分子をHaloTag標識したノックイン細胞を作製し、シングルセルソーティングによりシングルセルクーンを得た。作製したHaloTag標識ノックイン細胞に蛍光HaloTagリガンドを添加することにより、その細胞内局在をイメージング解析し、十分な蛍光強度が得られることを確認した。
②分子接着剤合成とin vitroおよびin vivo薬効試験
状態検知可能な倒立顕微鏡を導入し、①で作製したノックイン細胞を活用し、HaloTag標識による96wellのスクリーニングアッセイ系を構築した。次年度実施予定の2種類のマウスモデルについて、その解析手法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Halo-PROTACを用いた標的分子分解実験のために必須のHaloTag発現細胞を予定通り樹立できた。スクリーニングアッセイ系やマウスモデルも概ね計画通りに進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
予定通り、骨芽細胞やセメント芽細胞分化に重要な転写因子群のHaloTag発現細胞を作製し、HaloPROTACを添加した後、効率的に分解される標的転写因子をイメージング解析およびウェスタンブロットにより同定する。さらにin vitro培養系およびマウスモデルでその効果を検討する。
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